国槐丛枝病植原体的分子检测与鉴定
：以南京国槐丛枝症状的叶片为试验材料，先提取国槐丛枝病株叶片的DNA，经过巢式PCR 扩增植原体的特异性16S rDNA片段，对PCR产物进行纯化、连接到pMD19-T载体上转化到大肠杆菌DH5a中，挑取阳性转化子进行测序和分析,获得丛枝病植原体的16S rDNA 片段为1248 bp。通过序列同源性比较，表明国槐丛枝病样品中检测到的植原体与杏卷叶病植原体YS（FJ572660）同源性高达99%，应属于16S rV 组，暂且命名为国槐丛枝病植原体 (Candidatus Phytoplasma SJWB)，确定了国槐丛枝病植原体的分类地位。结合虚拟的RFLP分析，确定该植原体属于B亚组。在后续的试验中，我们对植原体一种重要的毒力因子溶血素基因（HlyC）进行了探索，溶血素为细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素，是病原菌重要的毒力因子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1植物总DNA提取5
1.2.2PCR扩增5
1.2.3 PCR产物回收5
1.2.4克隆目的片段5
1.2.5阳性克隆6
1.2.6目标序列的测序及分析6
1.2.7 在线工具iPhyClssifier分析16S r DNA 序列6
1.2.8致病因子的探索7
2 结果与分析7
2.1国槐丛枝症状的田间症状7
2.2 国槐丛枝病植原体16S r DNA序列分析7
2.3 国槐植原体的系统分类和发育学分析9
2.4 致病因子的探索13
3讨论 14
致谢15
参考文献16
国槐丛枝病植原体的分子检测与鉴定
生物科学 许晶月
引言
植原体（phytoplasma），原称类菌原体（Mycoplasmalike organism），为单细胞原核生物，无细胞壁，有生物膜包围，至今仍不能进行人工培养[1]，隶属
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
于细菌界(Bacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，定殖于植物韧皮部筛管部位以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾液腺等组织的类似植物病原细菌的生物体；对四环类抗生素敏感，而对青霉素不敏感[2]；对洋地黄皂苷有抵抗力，且对低渗的盐溶液敏感，与非固醇的柔膜成员较为相似。植原体通过韧皮部取食汁液的昆虫、无性繁殖方式嫁接或攀援类植物等方式传播，目前世界上已经发现有1000多种植物病害与该微生物有关系，主要引起的植物症状有丛枝、黄化、矮缩、小叶、卷叶、花变绿叶，可侵染的植物可以涉及粮食、蔬菜、花卉、林木、果树、药材、牧草等，给经济作物造成了巨大的损失，我国大陆已经报道有100多种植物与植原体病害有关，病害发生地区及严重程度各不相同[3]。因此，深入了解植原体的系统分类学地位、传播特点、致病机理等将会对今后植原体的防治工作显得尤为重要[4]。
植原体引起的病害较为广泛，发病最后往往会导致植物的死亡，给人们的生产带来巨大损失，早前人们一直认为植物上的病害多是由病毒、真菌、线虫等引起的，很少有人关注到细菌引起的病害，随着日本科学家在1967年首次利用电子显微镜观察有丛枝症状的桑树、矮牵牛、马铃薯和泡桐4种植物韧皮部筛管细胞中存在形态结构类似动物菌原体的微生物（现称为植原体）以来，国内外人们也逐渐加紧了对植原体的研究，但是由于起步较晚以及植原体不能进行人工分离培养等因素的限制，其整体进展较为缓慢。本研究首先着手于江苏省南京市玄武区周围的植原体病害的调查，了解植原体在江苏省的发病情况以及严重程度；其次，对存在的植原体做系统发育学分析，搞清具体的分类学地位，探明基因的进化过程；最后，寻找潜在的致病因子或相关代谢途径探索植原体引起植物组织或器官发病的机理[5]。
早期的植原体研究主要集中在寄主植物、致病症状、媒介昆虫以及介体专化性等生物学性状的描述，并且人们通过染色并结合光学显微镜已经建立了多种组织化学的技术应用于植原体的检测，虽然组织化学检测方法对植原体的检测结果比较可靠，但是只能作为初步确定结果[6]。进入90年代，PCR技术、分子克隆、序列测定技术的广泛应用,为研究DNA的分子结构提供更为方便、有效的手段,极大地促进了植原体研究。在整个柔膜菌纲的分类鉴定中，16S rDNA是系统发育的首选标记。特别是像植原体这类尚不能人工培养的微生物, 分子标记尤其重要。因而准确测定16S rDNA序列是确定一种植原体的分类地位和命名新的植原体候选种的基础和必需步骤之一。越来越多的研究发现, 有时仅根据16S rDNA序列不足以做到对植原体种类科学并且系统的划分[7]。用相对不及16S rDNA保守的其它基因或区域, 例如16S23S rDNA间区、rp (ribosome protein)基因、转运蛋白secY基因、外膜蛋白OMP基因和延伸因子(elongation factors，EF) tuf基因等[8]，能将同一16Sr组内成员进一步区分为不同的亚组。因此可以依据以上基因设计出特异性引物在亚组(或种以下)水平上对其做进一步的分类。经PCR扩增后的16S rDNA及其它DNA扩增产物的RFLP分析[9]，可以作为区分和鉴定植原体的一种简便、可靠、实用的方法，有助于揭示植原体之间的同源性和系统发育关系及遗传相关性，为研究植原体的致病机理提供必要信息。
溶血素( hemolysin ) 又称溶细胞素( cytotoxin)，是一大类由病原微生物产生的能导致细胞裂解的毒素蛋白总称。目前关于细菌溶血素的研究主要集中在动物病原菌上，有关植物病原菌溶血素研究的报道并不多，仅见于翠菊黄化病植原体、洋葱黄化病植原体和澳大利亚植原体候选种及小麦蓝矮病植原体[10]。植原体作为一类胞内寄生菌，在长期的进化过程中形成了其独特的致病机制，已有的基因组信息表明，植原体基因组中不含有任何与已知致病基因同源的基因。由于植原体不能体外培养，限制了在分子水平上对其致病机制的认识，目前对于其致病机制及致病因子的研究进展缓慢。通过对已有 4 种植原体的全基因组序列信息分析发现，在植原体基因组中具有一个编码溶血素的基因[11]。然而，作为动物病原菌重要致病因子的溶血素在植原体致病过程中的作用目前还不清楚。本研究利用同源克隆方法克隆国槐丛枝病植原体溶血素全长基因，通过生物信息学方法分析其序列特征，检测该溶血素基因是否存在于患有丛枝病的国槐,为深入研究国槐丛枝病植原体溶血素基因在植原体致病过程中的作用奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1植物总DNA提取5
1.2.2PCR扩增5
1.2.3 PCR产物回收5
1.2.4克隆目的片段5
1.2.5阳性克隆6
1.2.6目标序列的测序及分析6
1.2.7 在线工具iPhyClssifier分析16S r DNA 序列6
1.2.8致病因子的探索7
2 结果与分析7
2.1国槐丛枝症状的田间症状7
2.2 国槐丛枝病植原体16S r DNA序列分析7
2.3 国槐植原体的系统分类和发育学分析9
2.4 致病因子的探索13
3讨论 14
致谢15
参考文献16
国槐丛枝病植原体的分子检测与鉴定
生物科学 许晶月
引言
植原体（phytoplasma），原称类菌原体（Mycoplasmalike organism），为单细胞原核生物，无细胞壁，有生物膜包围，至今仍不能进行人工培养[1]，隶属
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
于细菌界(Bacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，定殖于植物韧皮部筛管部位以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾液腺等组织的类似植物病原细菌的生物体；对四环类抗生素敏感，而对青霉素不敏感[2]；对洋地黄皂苷有抵抗力，且对低渗的盐溶液敏感，与非固醇的柔膜成员较为相似。植原体通过韧皮部取食汁液的昆虫、无性繁殖方式嫁接或攀援类植物等方式传播，目前世界上已经发现有1000多种植物病害与该微生物有关系，主要引起的植物症状有丛枝、黄化、矮缩、小叶、卷叶、花变绿叶，可侵染的植物可以涉及粮食、蔬菜、花卉、林木、果树、药材、牧草等，给经济作物造成了巨大的损失，我国大陆已经报道有100多种植物与植原体病害有关，病害发生地区及严重程度各不相同[3]。因此，深入了解植原体的系统分类学地位、传播特点、致病机理等将会对今后植原体的防治工作显得尤为重要[4]。
植原体引起的病害较为广泛，发病最后往往会导致植物的死亡，给人们的生产带来巨大损失，早前人们一直认为植物上的病害多是由病毒、真菌、线虫等引起的，很少有人关注到细菌引起的病害，随着日本科学家在1967年首次利用电子显微镜观察有丛枝症状的桑树、矮牵牛、马铃薯和泡桐4种植物韧皮部筛管细胞中存在形态结构类似动物菌原体的微生物（现称为植原体）以来，国内外人们也逐渐加紧了对植原体的研究，但是由于起步较晚以及植原体不能进行人工分离培养等因素的限制，其整体进展较为缓慢。本研究首先着手于江苏省南京市玄武区周围的植原体病害的调查，了解植原体在江苏省的发病情况以及严重程度；其次，对存在的植原体做系统发育学分析，搞清具体的分类学地位，探明基因的进化过程；最后，寻找潜在的致病因子或相关代谢途径探索植原体引起植物组织或器官发病的机理[5]。
早期的植原体研究主要集中在寄主植物、致病症状、媒介昆虫以及介体专化性等生物学性状的描述，并且人们通过染色并结合光学显微镜已经建立了多种组织化学的技术应用于植原体的检测，虽然组织化学检测方法对植原体的检测结果比较可靠，但是只能作为初步确定结果[6]。进入90年代，PCR技术、分子克隆、序列测定技术的广泛应用,为研究DNA的分子结构提供更为方便、有效的手段,极大地促进了植原体研究。在整个柔膜菌纲的分类鉴定中，16S rDNA是系统发育的首选标记。特别是像植原体这类尚不能人工培养的微生物, 分子标记尤其重要。因而准确测定16S rDNA序列是确定一种植原体的分类地位和命名新的植原体候选种的基础和必需步骤之一。越来越多的研究发现, 有时仅根据16S rDNA序列不足以做到对植原体种类科学并且系统的划分[7]。用相对不及16S rDNA保守的其它基因或区域, 例如16S23S rDNA间区、rp (ribosome protein)基因、转运蛋白secY基因、外膜蛋白OMP基因和延伸因子(elongation factors，EF) tuf基因等[8]，能将同一16Sr组内成员进一步区分为不同的亚组。因此可以依据以上基因设计出特异性引物在亚组(或种以下)水平上对其做进一步的分类。经PCR扩增后的16S rDNA及其它DNA扩增产物的RFLP分析[9]，可以作为区分和鉴定植原体的一种简便、可靠、实用的方法，有助于揭示植原体之间的同源性和系统发育关系及遗传相关性，为研究植原体的致病机理提供必要信息。
溶血素( hemolysin ) 又称溶细胞素( cytotoxin)，是一大类由病原微生物产生的能导致细胞裂解的毒素蛋白总称。目前关于细菌溶血素的研究主要集中在动物病原菌上，有关植物病原菌溶血素研究的报道并不多，仅见于翠菊黄化病植原体、洋葱黄化病植原体和澳大利亚植原体候选种及小麦蓝矮病植原体[10]。植原体作为一类胞内寄生菌，在长期的进化过程中形成了其独特的致病机制，已有的基因组信息表明，植原体基因组中不含有任何与已知致病基因同源的基因。由于植原体不能体外培养，限制了在分子水平上对其致病机制的认识，目前对于其致病机制及致病因子的研究进展缓慢。通过对已有 4 种植原体的全基因组序列信息分析发现，在植原体基因组中具有一个编码溶血素的基因[11]。然而，作为动物病原菌重要致病因子的溶血素在植原体致病过程中的作用目前还不清楚。本研究利用同源克隆方法克隆国槐丛枝病植原体溶血素全长基因，通过生物信息学方法分析其序列特征，检测该溶血素基因是否存在于患有丛枝病的国槐,为深入研究国槐丛枝病植原体溶血素基因在植原体致病过程中的作用奠定基础。
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