拟南芥rabe1d在主根拟南芥rabe1d在主根发育中的初步功能研究【字数：9334】
本课题研究内容为拟南芥RAB家族小G蛋白中的RAB-E1d在主根发育中的功能。Rab 家族小G蛋白是一类能够调控囊泡运输过程的小G蛋白。RABE是RAB家族小G蛋白的一个亚家族，它被证明与细胞外泌途径中高尔基体向质膜的转运有关。因此，我们通过构建RAB-E1d的负显性突变体来观察其对主根发育表型的影响，从而研究RAB-E1d在主根发育过程中的作用。实验发现，RAB-E1d突变型的主根和根毛长度与野生型具有极显著性差异，且突变型中不正常形态根毛的比例更高，说明突变将会影响拟南芥主根和根毛的生长速度以及根毛的表型。通过用激光共聚焦显微镜观察相关marker的定位，猜测RAB-E1d可能是通过调控生长素运输和细胞板形成相关的囊泡运输来影响植株主根的发育。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1实验材料5
1.1.2主要实验试剂及其配置5
1.1.3主要实验用品与设备6
1.2 实验方法7
1.2.1 DNA样品的提取7
1.2.2 PCR扩增7
1.2.3 凝胶电泳 8
1.2.4 构建载体8
1.2.5 农杆菌转化 9
1.2.6 农杆菌侵染拟南芥9
1.2.7 RNA的提取9
1.2.8 反转录反应10
1.2.9 Realtime PCR 10
1.2.10拟南芥的培养10
2 结果分析11
2.1 DEX::RABE1d 和DEX::RABE1dDN突变体的PCR鉴定11
2.2 突变体主根的光学显微镜观察和长度测量12
2.2.1 突变体主根的光学显微镜观察 12
2.2.2 突变体主根的长度测量13
2.3 突变体根毛的光学显微镜观察和长度测量13
2.3.1 突变体根毛的光学显微镜观察 13
2.3.2 突变体根毛的长度测量14
2.4拟南芥marker在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
主根中的定位分析15
2.4.1 DR5GFP在主根中的定位分析 15
2.4.2 MCHVAMP 721在主根中的定位分析16
3 讨论16
致谢17
参考文献17
拟南芥RABE1d在主根发育中的初步功能研究
引言
根具有吸收、固定、贮藏和合成功能，是植物重要的营养器官。研究发现囊泡运输在植物主根的生长发育中发挥了关键作用，如在植物细胞的细胞壁合成、植物激素运输蛋白定位以及胞质分离等生理过程中。在植物中，Rab是一个一系列不同功能的蛋白大家族。 其中之一的RABE1d，已被证明参与细胞外分泌途径中高尔基体向质膜的转运。本研究通过构建RABE1d的负显性突变体RABE1dDN来观察其对主根发育表型的影响，从而研究RABE1d在主根发育过程中的作用。
植物的主根由种子萌发后的胚根突破种皮发育形成。主根的生长由根尖部分完成。根尖依次可分为：根冠区、分生区、伸长区和成熟区。由根管原始细胞层发育形成的根冠区的外层细胞与土壤颗粒接触，致使不断脱落，其内的分生组织细胞同时不断分裂补充，从而稳定根管区厚度的动态平衡。根的生长主要由分生区细胞完成。分生区细胞通过分裂增生使根尖加粗加长。由分生区细胞生长而来的伸长区细胞，相对伸长得更加明显。根尖的伸长主要依赖于伸长区细胞的延伸。成熟区的根毛是根完成吸收功能的主要结构，由伸长区细胞进一步分化形成。
细胞外泌，是指细胞依靠生物膜的流动性原理来实现囊泡与生物膜的融合与分离，从而将囊泡包裹的物质运出细胞的生理过程。通过这种方式，细胞能消耗能量将细胞内大分子物质向细胞外分泌运输。
真核细胞的各种细胞器是利用膜结构通过间隔区隔化形成的，而质膜又与这些膜结构一起构成了复杂的生物膜结构。通过这一生物膜结构之间的膜运输，细胞实现了细胞器之间甚至细胞之间的物质以及信息交流，并奠定了细胞生命活动的基础[1]。
目前，研究发现囊泡运输在植物细胞壁合成、植物激素运输蛋白定位以及胞质分离等生理过程中均发挥重要功能。
细胞壁主要由在细胞质膜合成的纤维素、在高尔基体合成的半纤维素和果胶质等结构多糖及少量蛋白质等物质构成 [2]。因此在细胞壁物质完成合成后，需要在胞内将细胞壁物质通过囊泡运输定向转运到胞外进行组装与沉积。因此，细胞外泌过程在植物细胞壁的合成中发挥重要作用。
植物激素需要相关运输蛋白的帮助来完成在植物体内的极性运输，即植物激素从形态学上端转运到形态学下端。细胞通过调控平衡输入载体和输出载体，来对植物激素极性运输进行控制。而不少证据显示细胞外泌相关的蛋白在运输囊泡向目标膜上的定位这一过程中起到了调节作用[3]。因此，细胞外泌过程在植物激素运输蛋白的定位中发挥重要作用。
植物胞质分裂的特征是在细胞分裂面形成细胞板膜结构。在囊泡运输过程中，定位于靶膜和定位于囊膜的蛋白将会装配形成具有功能的复合体，从而来促进囊泡与靶膜的融合[4]。而这一膜融合过程将会通过微丝与囊泡之间的紧密联系，来促进细胞板的形成以及细胞板的成熟进而形成新的细胞壁[5]。因此，细胞外泌过程在胞质分离中发挥重要作用。
Ras，Rho，Arf，Rab和Ran与Ras五个不同的亚家族组成小GTP酶家族，其中的Rab蛋白亚家族是小G蛋白中成员最多的一个。
Rab 蛋白是一类分子量大约为2030 kD的一般以单体形式出现的小G蛋白，与真核细胞的囊泡运输、细胞增殖、和骨架组装等生理过程有关 [6]。有研究表明，转基因植物中Rab蛋白水平的降低，将会使植物生长发育、形态等发生改变[7]。Rab蛋白起到分子开关的作用，即具有与GTP结合的“开”状态和与GDP结合的“关”状态。在胞内激活信号存在时，鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）将会激活与膜结合的Rab蛋白，使Rab从结合GDP的无活性形式转变为结合GTP的活性形式，然后下游蛋白与活化的Rab蛋白上的效应器结构域相互作用，从而启动下游的细胞相应的生理过程。Rab蛋白具有的GTP水解酶活性，被GTP酶活化蛋白 （GAP）激活后，通过GTP 的加速水解， 促使 Rab 快速失活，从而迅速终止细胞信号的传递，终止相应的生理过程[8]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1实验材料5
1.1.2主要实验试剂及其配置5
1.1.3主要实验用品与设备6
1.2 实验方法7
1.2.1 DNA样品的提取7
1.2.2 PCR扩增7
1.2.3 凝胶电泳 8
1.2.4 构建载体8
1.2.5 农杆菌转化 9
1.2.6 农杆菌侵染拟南芥9
1.2.7 RNA的提取9
1.2.8 反转录反应10
1.2.9 Realtime PCR 10
1.2.10拟南芥的培养10
2 结果分析11
2.1 DEX::RABE1d 和DEX::RABE1dDN突变体的PCR鉴定11
2.2 突变体主根的光学显微镜观察和长度测量12
2.2.1 突变体主根的光学显微镜观察 12
2.2.2 突变体主根的长度测量13
2.3 突变体根毛的光学显微镜观察和长度测量13
2.3.1 突变体根毛的光学显微镜观察 13
2.3.2 突变体根毛的长度测量14
2.4拟南芥marker在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
主根中的定位分析15
2.4.1 DR5GFP在主根中的定位分析 15
2.4.2 MCHVAMP 721在主根中的定位分析16
3 讨论16
致谢17
参考文献17
拟南芥RABE1d在主根发育中的初步功能研究
引言
根具有吸收、固定、贮藏和合成功能，是植物重要的营养器官。研究发现囊泡运输在植物主根的生长发育中发挥了关键作用，如在植物细胞的细胞壁合成、植物激素运输蛋白定位以及胞质分离等生理过程中。在植物中，Rab是一个一系列不同功能的蛋白大家族。 其中之一的RABE1d，已被证明参与细胞外分泌途径中高尔基体向质膜的转运。本研究通过构建RABE1d的负显性突变体RABE1dDN来观察其对主根发育表型的影响，从而研究RABE1d在主根发育过程中的作用。
植物的主根由种子萌发后的胚根突破种皮发育形成。主根的生长由根尖部分完成。根尖依次可分为：根冠区、分生区、伸长区和成熟区。由根管原始细胞层发育形成的根冠区的外层细胞与土壤颗粒接触，致使不断脱落，其内的分生组织细胞同时不断分裂补充，从而稳定根管区厚度的动态平衡。根的生长主要由分生区细胞完成。分生区细胞通过分裂增生使根尖加粗加长。由分生区细胞生长而来的伸长区细胞，相对伸长得更加明显。根尖的伸长主要依赖于伸长区细胞的延伸。成熟区的根毛是根完成吸收功能的主要结构，由伸长区细胞进一步分化形成。
细胞外泌，是指细胞依靠生物膜的流动性原理来实现囊泡与生物膜的融合与分离，从而将囊泡包裹的物质运出细胞的生理过程。通过这种方式，细胞能消耗能量将细胞内大分子物质向细胞外分泌运输。
真核细胞的各种细胞器是利用膜结构通过间隔区隔化形成的，而质膜又与这些膜结构一起构成了复杂的生物膜结构。通过这一生物膜结构之间的膜运输，细胞实现了细胞器之间甚至细胞之间的物质以及信息交流，并奠定了细胞生命活动的基础[1]。
目前，研究发现囊泡运输在植物细胞壁合成、植物激素运输蛋白定位以及胞质分离等生理过程中均发挥重要功能。
细胞壁主要由在细胞质膜合成的纤维素、在高尔基体合成的半纤维素和果胶质等结构多糖及少量蛋白质等物质构成 [2]。因此在细胞壁物质完成合成后，需要在胞内将细胞壁物质通过囊泡运输定向转运到胞外进行组装与沉积。因此，细胞外泌过程在植物细胞壁的合成中发挥重要作用。
植物激素需要相关运输蛋白的帮助来完成在植物体内的极性运输，即植物激素从形态学上端转运到形态学下端。细胞通过调控平衡输入载体和输出载体，来对植物激素极性运输进行控制。而不少证据显示细胞外泌相关的蛋白在运输囊泡向目标膜上的定位这一过程中起到了调节作用[3]。因此，细胞外泌过程在植物激素运输蛋白的定位中发挥重要作用。
植物胞质分裂的特征是在细胞分裂面形成细胞板膜结构。在囊泡运输过程中，定位于靶膜和定位于囊膜的蛋白将会装配形成具有功能的复合体，从而来促进囊泡与靶膜的融合[4]。而这一膜融合过程将会通过微丝与囊泡之间的紧密联系，来促进细胞板的形成以及细胞板的成熟进而形成新的细胞壁[5]。因此，细胞外泌过程在胞质分离中发挥重要作用。
Ras，Rho，Arf，Rab和Ran与Ras五个不同的亚家族组成小GTP酶家族，其中的Rab蛋白亚家族是小G蛋白中成员最多的一个。
Rab 蛋白是一类分子量大约为2030 kD的一般以单体形式出现的小G蛋白，与真核细胞的囊泡运输、细胞增殖、和骨架组装等生理过程有关 [6]。有研究表明，转基因植物中Rab蛋白水平的降低，将会使植物生长发育、形态等发生改变[7]。Rab蛋白起到分子开关的作用，即具有与GTP结合的“开”状态和与GDP结合的“关”状态。在胞内激活信号存在时，鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）将会激活与膜结合的Rab蛋白，使Rab从结合GDP的无活性形式转变为结合GTP的活性形式，然后下游蛋白与活化的Rab蛋白上的效应器结构域相互作用，从而启动下游的细胞相应的生理过程。Rab蛋白具有的GTP水解酶活性，被GTP酶活化蛋白 （GAP）激活后，通过GTP 的加速水解， 促使 Rab 快速失活，从而迅速终止细胞信号的传递，终止相应的生理过程[8]。
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