精恶唑禾草灵水解酶基因afeh的克隆表达及酶学特性研究
：精噁唑禾草灵是一种内吸传导型选择性芽后除草剂。我们通过富集培养，得到一株高效降解精噁唑禾草灵菌株DL-2，经鉴定属于 Acinetobacter sp，该菌株的降解能力高于已报道的其他菌株。把降解产物精恶唑禾草酸用HPLC/MS进行分析。从DL-2菌株中通过克隆获得一种全新的精恶唑禾草灵降解脂酶基因AfeH，并且在大肠杆菌中进行功能性表达。重组酶AfeH对精噁唑禾草灵的比酶活力是216.39 U·mg protein-1。AfeH也能够水解多种芳氧丙酸类除草剂、对硝基苯类化合物以及三酰甘油脂。重组酶AfeH的最适pH和温度分别是9.0和50 ℃。Co2+对酶活力有促进作用， Ca2+, Zn2+, Ba2+对其有轻微的抑制作用。SDS和PMSF对酶活力有强烈的抑制作用
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 培养基及试剂 2
1.2 本文使用的菌株、质粒和引物 2
1.3 菌体总DNA的提取 2
1.3.1菌体总DNA的提取 2
1.3.2 菌株DL2总DNA的Sau3A I酶切与片段回收 3
1.3.3酶连 3
1.3.4 高效感受态细胞的制备 3
1.3.5酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 3
1.3.6质粒DNA的提取 3
1.3.7 序列测定与分析 4
1.4 精噁唑禾草灵水解酯酶基因afeH的PCR扩增及TA克隆 4
1.4.1精噁唑禾草灵水解酶基因feh的PCR扩增 4
1.4.2 PCR产物加A尾 4
1.4.3 酶连 5
1.4.4 酶连产物的转化和阳性克隆的筛选 5
1.4.5 质粒的小量提取和Nde I和Xho I双酶切验证 5
1.5表达载体pET29afeh的构建 5
1.5.1目的基因的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.5.2 pET29a(+)的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.5.3表达载体pET2
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9a(+)afeH的构建 6
1.5.4 pET29a(+)afeH表达菌株的构建 6
1.5.5 表达菌株的功能验证 6
1.6 重组酶AfeH酶学特性研究 6
1.6.1重组酶AfeH的诱导表达 6
1.6.2 重组酶AfeH的亲和层析纯化 6
1.6.3 重组酶AfeH的底物特异性 7
1.6.4 重组酶AfeH对不同底物Km值和Vmax测定 7
1.6.5 温度和pH值对重组酶AfeH活性和稳定性的影响 7
1.6.6 金属离子对重组酶AfeH活性的影响 7
1.6.7 有机溶剂、表面活性剂、螯合剂对重组酶AfeH活性的影响 7
2 结果与分析 7
2.1 菌株DL2基因组文库的构建 7
2.1.1 菌株DL2总DNA的提取与Sau3A I酶切 7
2.1.2含有精噁唑禾草灵水解酯酶的阳性克隆子筛选 8
2.2 基因测序与序列分析 9
2.4 FE水解酶基因afeH的PCR扩增及表达载体pET29a(+)afeH的构建 10
2.5 表达载体pET29a(+)afeH的功能验证 10
2.6重组AfeH的IPTG诱导表达 11
2.7重组AfeH的亲和层析纯化 11
2.8 重组AfeH 底物特异性 12
2.9 pH和温度对重组酶AfeH活性和稳定性的影响 13
2.10 金属离子对重组酶AfeH活性的影响 14
2.11 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶AfeH活性的影响 14
3 讨论 15
致谢 15
参考文献： 16
精噁唑禾草灵水解酶基因afeH的克隆表达及酶学特性研究
引言
精噁唑禾草灵(fenoxaproppethyl，FE)，化学名称[(R)2[4(6氯1,3苯并噁唑2氧基)苯氧基]丙酸(乙酯)]，是由德国Hoechst公司，开发出来的一种防除禾本科杂草的芳氧丙酸类除草剂，属于内吸传导型选择性芽后除草剂[1]。FE主要用于防除麦田中野燕麦、看麦娘等禾本科杂草，也可防除豆类、甜菜、棉花、亚麻、花生和蔬菜田的一年生和多年生禾本科杂草，因其具有施药适期长、选择性高、除草效果显著等特点，目前在世界及我国使用很广[2]。
精噁唑禾草灵原药外观为米色至棕色无定形的固体，略带芳香气味，分子量为361.78。20 ℃时蒸气压为19 nPa，熔点80～84 ℃。在水中的溶解度0.7 mgL1，丙酮中大于500 gL1，环己烷、乙醇、正辛醇中大于10 gL1，乙酸乙酯中大于200 gL1，甲苯中大于300 gL1。50 ℃下稳定6个月，对光不敏感，酸或pH>9条件下易分解[3,4]。
到目前为止，关于芳氧苯氧丙酸类除草剂微生物降解的研究并不是很多，并且都局限在降解菌株的分离和降解特性的研究，其中绝大多数菌株仅能在胞内酯酶的作用下将精噁唑禾草灵转化为精噁唑禾草灵酸。大学的侯颖[5]从被精噁唑禾草灵污染的土壤中分离到一株红球菌Rhodococcus sp. T1，该菌可以在24小时内将100 mgL1的精噁唑禾草灵转化为精噁唑禾草灵酸，并通过鸟枪法建库的方法克隆精噁唑禾草灵水解酯酶基因feh。Nie等[6]报道从稻田土壤中分离一株菌株Pseudomonas azotoformans QDZ1可以氰氟草酯为唯一碳源进行生长，5 d内可将100 mgL1的氰氟草酯降解84.5%；该菌株还可以降解精噁唑禾草灵，新的芳氧苯氧丙酸类除草剂水解酯酶基因Cyb也通过建库的方式被获得。Li等[7]研究乙草胺代谢中间体2氯N(2’甲基6’乙基苯基)乙酰胺降解菌Sphingomonas sp. DC2,并从中克隆到一种具有酯酶活性的水解酰胺酶基因CmeH，该酶亦可以将精噁唑禾草灵转化成精噁唑禾草灵酸。
1 材料与方法
1.1 培养基及试剂
LB培养基(gL1)：酵母粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH7.0，固体培养基添加琼脂粉15.0。
SOB培养基(gL1)：蛋白胨 20.0， 酵母粉 5.0， NaCl 0.5， KCl 0.186，pH7.0，用前加入灭菌的MgCl2至终浓度10 mM。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 培养基及试剂 2
1.2 本文使用的菌株、质粒和引物 2
1.3 菌体总DNA的提取 2
1.3.1菌体总DNA的提取 2
1.3.2 菌株DL2总DNA的Sau3A I酶切与片段回收 3
1.3.3酶连 3
1.3.4 高效感受态细胞的制备 3
1.3.5酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 3
1.3.6质粒DNA的提取 3
1.3.7 序列测定与分析 4
1.4 精噁唑禾草灵水解酯酶基因afeH的PCR扩增及TA克隆 4
1.4.1精噁唑禾草灵水解酶基因feh的PCR扩增 4
1.4.2 PCR产物加A尾 4
1.4.3 酶连 5
1.4.4 酶连产物的转化和阳性克隆的筛选 5
1.4.5 质粒的小量提取和Nde I和Xho I双酶切验证 5
1.5表达载体pET29afeh的构建 5
1.5.1目的基因的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.5.2 pET29a(+)的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.5.3表达载体pET2
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9a(+)afeH的构建 6
1.5.4 pET29a(+)afeH表达菌株的构建 6
1.5.5 表达菌株的功能验证 6
1.6 重组酶AfeH酶学特性研究 6
1.6.1重组酶AfeH的诱导表达 6
1.6.2 重组酶AfeH的亲和层析纯化 6
1.6.3 重组酶AfeH的底物特异性 7
1.6.4 重组酶AfeH对不同底物Km值和Vmax测定 7
1.6.5 温度和pH值对重组酶AfeH活性和稳定性的影响 7
1.6.6 金属离子对重组酶AfeH活性的影响 7
1.6.7 有机溶剂、表面活性剂、螯合剂对重组酶AfeH活性的影响 7
2 结果与分析 7
2.1 菌株DL2基因组文库的构建 7
2.1.1 菌株DL2总DNA的提取与Sau3A I酶切 7
2.1.2含有精噁唑禾草灵水解酯酶的阳性克隆子筛选 8
2.2 基因测序与序列分析 9
2.4 FE水解酶基因afeH的PCR扩增及表达载体pET29a(+)afeH的构建 10
2.5 表达载体pET29a(+)afeH的功能验证 10
2.6重组AfeH的IPTG诱导表达 11
2.7重组AfeH的亲和层析纯化 11
2.8 重组AfeH 底物特异性 12
2.9 pH和温度对重组酶AfeH活性和稳定性的影响 13
2.10 金属离子对重组酶AfeH活性的影响 14
2.11 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶AfeH活性的影响 14
3 讨论 15
致谢 15
参考文献： 16
精噁唑禾草灵水解酶基因afeH的克隆表达及酶学特性研究
引言
精噁唑禾草灵(fenoxaproppethyl，FE)，化学名称[(R)2[4(6氯1,3苯并噁唑2氧基)苯氧基]丙酸(乙酯)]，是由德国Hoechst公司，开发出来的一种防除禾本科杂草的芳氧丙酸类除草剂，属于内吸传导型选择性芽后除草剂[1]。FE主要用于防除麦田中野燕麦、看麦娘等禾本科杂草，也可防除豆类、甜菜、棉花、亚麻、花生和蔬菜田的一年生和多年生禾本科杂草，因其具有施药适期长、选择性高、除草效果显著等特点，目前在世界及我国使用很广[2]。
精噁唑禾草灵原药外观为米色至棕色无定形的固体，略带芳香气味，分子量为361.78。20 ℃时蒸气压为19 nPa，熔点80～84 ℃。在水中的溶解度0.7 mgL1，丙酮中大于500 gL1，环己烷、乙醇、正辛醇中大于10 gL1，乙酸乙酯中大于200 gL1，甲苯中大于300 gL1。50 ℃下稳定6个月，对光不敏感，酸或pH>9条件下易分解[3,4]。
到目前为止，关于芳氧苯氧丙酸类除草剂微生物降解的研究并不是很多，并且都局限在降解菌株的分离和降解特性的研究，其中绝大多数菌株仅能在胞内酯酶的作用下将精噁唑禾草灵转化为精噁唑禾草灵酸。大学的侯颖[5]从被精噁唑禾草灵污染的土壤中分离到一株红球菌Rhodococcus sp. T1，该菌可以在24小时内将100 mgL1的精噁唑禾草灵转化为精噁唑禾草灵酸，并通过鸟枪法建库的方法克隆精噁唑禾草灵水解酯酶基因feh。Nie等[6]报道从稻田土壤中分离一株菌株Pseudomonas azotoformans QDZ1可以氰氟草酯为唯一碳源进行生长，5 d内可将100 mgL1的氰氟草酯降解84.5%；该菌株还可以降解精噁唑禾草灵，新的芳氧苯氧丙酸类除草剂水解酯酶基因Cyb也通过建库的方式被获得。Li等[7]研究乙草胺代谢中间体2氯N(2’甲基6’乙基苯基)乙酰胺降解菌Sphingomonas sp. DC2,并从中克隆到一种具有酯酶活性的水解酰胺酶基因CmeH，该酶亦可以将精噁唑禾草灵转化成精噁唑禾草灵酸。
1 材料与方法
1.1 培养基及试剂
LB培养基(gL1)：酵母粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH7.0，固体培养基添加琼脂粉15.0。
SOB培养基(gL1)：蛋白胨 20.0， 酵母粉 5.0， NaCl 0.5， KCl 0.186，pH7.0，用前加入灭菌的MgCl2至终浓度10 mM。
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