养殖水体中硝酸细菌的筛选及其对亚硝酸盐净化效果的研究【字数：11363】
本文对从常熟市某养殖场水体中筛选到的硝酸细菌（亚硝酸氧化细菌）的亚硝酸盐氧化能力进行了研究。在30℃、180r/min条件下使用富集培养基富集培养后，分别利用硅胶分离平板和水洗琼脂平板进行分离纯化，经2次富集-分离后共获得16株具有亚硝酸盐氧化能力的菌株。通过反向证明试验，进一步筛选出p10、q1和q3三株化能自养的硝酸细菌，其中q1菌株的亚硝酸氧化活性较强。对模拟废水的试验结果表明，当投加量（mL/L)分别为0.05、0.1和0.2时，q1菌株对0.1mg/L亚硝酸盐的氧化率分别为83%、91%和95%；当亚硝酸盐浓度（mg/L）分别为0.05、0.1和0.2时，0.1mL/L投加量的q1菌株对亚硝酸盐的氧化率分别为64%、85%和83%。对养殖水体的试验结果表明，0.1mL/L投加量的q1菌株在4天内对亚硝酸盐的氧化率可达到66%，对养殖水体中的亚硝酸盐具有明显的净化效果。
目录
1.引言 1
1.1硝化细菌的分类、特性和作用机理 1
1.2养殖水体中亚硝酸盐的来源和危害 1
1.3水体中亚硝酸盐处理方法 2
1.4硝化细菌微生态制剂的研究进展 3
1.5研究课题的目的和意义 3
2.材料与方法 4
2.1硝酸细菌的富集、分离、纯化材料 4
2.1.1样品来源 4
2.1.2实验材料 4
2.1.3主要培养基 4
2.2实验结果 5
2.2.1 亚硝酸氧化细菌的富集与分离 5
2.2.2硝酸菌的筛选 6
2.2.3测试硝酸菌对亚硝酸盐的氧化效果 6
2.3保藏方法 8
3.结果与分析 9
3.1富集与分离结果 9
3.2亚硝酸盐标准曲线 12
3.3硝酸菌对亚硝酸盐的氧化效果 12
3.3.1不同接种量硝酸细菌对模拟废水中亚硝酸盐的氧化效果 12
3.3.2相同量硝酸细菌对不同量亚硝酸根模拟废水的氧化效果 13
3.3.3分离出的硝酸细菌对养殖水体中亚硝酸盐的氧化效果 14
4.总结与展望 16
4.1总结 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
16
4.2展望 16
参考文献 18
致谢 19
1引言
由于全面建设小康社会的不断推进，人们的物质水平也越来越高，随着人类需求的增长，水产养殖业得到了迅猛发展。在自然界中，亚硝酸盐在水体中普遍存在，低浓度的亚硝酸盐对生物不产生危害，而由于工业的迅猛发展，大量含氮物质进入水体，除此之外，高密度、高饲料的水产养殖也使得大量的氮在水体中累计。水体本身可以降解的亚硝酸盐氮有一定的限度，而大量氮的累计超过了水体自身菌群的限度，则氨氮氧化为亚硝酸盐氮后无法及时被氧化为硝酸盐，使得亚硝酸盐在水体中累计。高浓度的亚硝酸盐在水体中会对水生生物造成不良影响，并且亚硝酸盐等强致癌物质会在生物体内通过食物链进行富集，人们食用了这一类体内富集了亚硝酸盐的生物，人的身体也会到损害。在观赏鱼的养殖中，亚硝酸盐过多也会使水体浑浊，不利于观赏和生物的健康。但随着科技的发展，人们采用了生物法、化学法或物理法来处理这类问题。其中生物法由于其危害小，消耗少而逐渐被人们广泛利用。在微生物学中，我们将氨氮氧化为亚硝酸盐氮再氧化为硝酸盐的过程称为硝化作用，这个过程主要是由硝化细菌所主导。在一般情况下，硝化细菌大多指的是化能自养型的硝化细菌[1]，而有的一样微生物也可以完成硝化作用，但效果比较低微，一般认为硝化作用主要是化能自养的硝化细菌完成的。
1.1硝化细菌的分类、特性和作用机理
硝化细菌分为亚硝化细菌和硝酸菌，他们分属于变形菌们的α，β，γ，δ的四个亚门[1]。硝化细菌大部分分布在河流、湖泊、水产养殖水体、污水处理中的活性污泥中等。除硝化杆菌属中的某些菌株为兼性自养菌外，大多数硝化细菌为专性化能无机营养菌，他们有一下几点特征[2]：①大部分是化能无机自养菌；②生长迟缓，平均10小时以上才能生长一代；③是专性好气菌，O2为最终电子受体；④无芽孢，大多数为G细菌；⑤细胞形态多样，如球形、杆状、螺旋形等；⑥大多数为二分裂；⑦大部分有复杂的膜内褶结构等。
硝化作用是在有氧状态下，硝化细菌将氨氮氧化为硝酸盐的过程。第一阶段：将氨（NH4+）氧化为亚硝酸盐（NO2），在氨氧化细菌的作用下。第二阶段：利用硝酸菌将亚硝酸盐（NO2）氧化为硝酸盐（NO3）。在这个总过程中获得的能量用于CO2的固定。硝化作用在自然界中对氮循环有着重要意义，对亚硝酸盐起着净化作用。
1.2养殖水体中亚硝酸盐的来源和危害
亚硝酸盐是自然界中是最广泛存在的，是硝化反应在不完全进行的过程中产生的中间产物[3]，是含氮有机化合物经过微生物分解生成氨，氨被氧化成亚硝酸的过程中产生的。在自然环境中，氮的循环是平衡的，其反应式为[4]：
① 2NH+4+ 3O2→2NO2+ 4H++ 2H2O + 能量
② 2NO－2+ O2→2NO－3+ 能量
③ C6H12O6+ 12NO－3→ 6H2O + 6CO2+12NO－2+ 能量
④ 5CH3COOH + 8NO－3→6H2O + 10CO2+4N2+ 8OH－+ 能量
反应①和反应②之所以可以顺利进行，得益于氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的分别作用。在过去的研究中，Avnimelech[5]和其他人发现,亚硝化细菌（即氨氧化细菌）繁殖速度快，而硝酸菌（即亚硝酸氧化细菌）生长速度慢，因此反应②所需时间比反应①长很多，导致亚硝态氮很容易累计。但由于反应③和反应④（脱氮作用）的存在，水体中的氮循环仍处在平衡状态。
影响亚硝酸氧化细菌的因素也很多，如溶解氧、温度等，pH也是重要因素之一。经科学家们的不断探索，得到亚硝酸氧化细菌最合适的条件为溶氧量1.52.0mg/L，温度2530℃，pH为7.37.5，避光生长。
在如今高密度的水产养殖模式下，由于不合理的投饵，养殖池塘长时间不清淤，养殖密度过大，工业或农业的污染[6]等原因，氮循环的动态平衡被打破，各种条件的改变，硝酸菌的失活以及高含氮的化合物的投放都会造成了亚硝酸盐的累计。亚硝酸盐在自然界中广泛存在，而当其浓度小于0.1毫克/升时，对水体中养殖的鱼类、虾类等不会产生危害；而当其浓度大于0.1毫克/升而小于0.5毫克／升时，生物就会中毒，出现鱼类进食量减少、鳃由正常颜色转变为暗紫红色、呼吸困难、游动速度明显下降、鱼群整体显得浮躁等不良现象；而当其浓度大于0.5毫克/升时，中毒现象更加明显，严重时可直接导致死亡[7]。亚硝酸盐致病（致死）的主要原因[8]是：血红蛋白是运输氧气的重要功能，而水生动物在水体中通过呼吸，使得亚硝酸盐进入血液，与血红蛋白结合形成了高铁血红蛋白，而高铁血红蛋白无法运输氧气，故而导致生物缺氧，而造成中毒症状。
目录
1.引言 1
1.1硝化细菌的分类、特性和作用机理 1
1.2养殖水体中亚硝酸盐的来源和危害 1
1.3水体中亚硝酸盐处理方法 2
1.4硝化细菌微生态制剂的研究进展 3
1.5研究课题的目的和意义 3
2.材料与方法 4
2.1硝酸细菌的富集、分离、纯化材料 4
2.1.1样品来源 4
2.1.2实验材料 4
2.1.3主要培养基 4
2.2实验结果 5
2.2.1 亚硝酸氧化细菌的富集与分离 5
2.2.2硝酸菌的筛选 6
2.2.3测试硝酸菌对亚硝酸盐的氧化效果 6
2.3保藏方法 8
3.结果与分析 9
3.1富集与分离结果 9
3.2亚硝酸盐标准曲线 12
3.3硝酸菌对亚硝酸盐的氧化效果 12
3.3.1不同接种量硝酸细菌对模拟废水中亚硝酸盐的氧化效果 12
3.3.2相同量硝酸细菌对不同量亚硝酸根模拟废水的氧化效果 13
3.3.3分离出的硝酸细菌对养殖水体中亚硝酸盐的氧化效果 14
4.总结与展望 16
4.1总结 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
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4.2展望 16
参考文献 18
致谢 19
1引言
由于全面建设小康社会的不断推进，人们的物质水平也越来越高，随着人类需求的增长，水产养殖业得到了迅猛发展。在自然界中，亚硝酸盐在水体中普遍存在，低浓度的亚硝酸盐对生物不产生危害，而由于工业的迅猛发展，大量含氮物质进入水体，除此之外，高密度、高饲料的水产养殖也使得大量的氮在水体中累计。水体本身可以降解的亚硝酸盐氮有一定的限度，而大量氮的累计超过了水体自身菌群的限度，则氨氮氧化为亚硝酸盐氮后无法及时被氧化为硝酸盐，使得亚硝酸盐在水体中累计。高浓度的亚硝酸盐在水体中会对水生生物造成不良影响，并且亚硝酸盐等强致癌物质会在生物体内通过食物链进行富集，人们食用了这一类体内富集了亚硝酸盐的生物，人的身体也会到损害。在观赏鱼的养殖中，亚硝酸盐过多也会使水体浑浊，不利于观赏和生物的健康。但随着科技的发展，人们采用了生物法、化学法或物理法来处理这类问题。其中生物法由于其危害小，消耗少而逐渐被人们广泛利用。在微生物学中，我们将氨氮氧化为亚硝酸盐氮再氧化为硝酸盐的过程称为硝化作用，这个过程主要是由硝化细菌所主导。在一般情况下，硝化细菌大多指的是化能自养型的硝化细菌[1]，而有的一样微生物也可以完成硝化作用，但效果比较低微，一般认为硝化作用主要是化能自养的硝化细菌完成的。
1.1硝化细菌的分类、特性和作用机理
硝化细菌分为亚硝化细菌和硝酸菌，他们分属于变形菌们的α，β，γ，δ的四个亚门[1]。硝化细菌大部分分布在河流、湖泊、水产养殖水体、污水处理中的活性污泥中等。除硝化杆菌属中的某些菌株为兼性自养菌外，大多数硝化细菌为专性化能无机营养菌，他们有一下几点特征[2]：①大部分是化能无机自养菌；②生长迟缓，平均10小时以上才能生长一代；③是专性好气菌，O2为最终电子受体；④无芽孢，大多数为G细菌；⑤细胞形态多样，如球形、杆状、螺旋形等；⑥大多数为二分裂；⑦大部分有复杂的膜内褶结构等。
硝化作用是在有氧状态下，硝化细菌将氨氮氧化为硝酸盐的过程。第一阶段：将氨（NH4+）氧化为亚硝酸盐（NO2），在氨氧化细菌的作用下。第二阶段：利用硝酸菌将亚硝酸盐（NO2）氧化为硝酸盐（NO3）。在这个总过程中获得的能量用于CO2的固定。硝化作用在自然界中对氮循环有着重要意义，对亚硝酸盐起着净化作用。
1.2养殖水体中亚硝酸盐的来源和危害
亚硝酸盐是自然界中是最广泛存在的，是硝化反应在不完全进行的过程中产生的中间产物[3]，是含氮有机化合物经过微生物分解生成氨，氨被氧化成亚硝酸的过程中产生的。在自然环境中，氮的循环是平衡的，其反应式为[4]：
① 2NH+4+ 3O2→2NO2+ 4H++ 2H2O + 能量
② 2NO－2+ O2→2NO－3+ 能量
③ C6H12O6+ 12NO－3→ 6H2O + 6CO2+12NO－2+ 能量
④ 5CH3COOH + 8NO－3→6H2O + 10CO2+4N2+ 8OH－+ 能量
反应①和反应②之所以可以顺利进行，得益于氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的分别作用。在过去的研究中，Avnimelech[5]和其他人发现,亚硝化细菌（即氨氧化细菌）繁殖速度快，而硝酸菌（即亚硝酸氧化细菌）生长速度慢，因此反应②所需时间比反应①长很多，导致亚硝态氮很容易累计。但由于反应③和反应④（脱氮作用）的存在，水体中的氮循环仍处在平衡状态。
影响亚硝酸氧化细菌的因素也很多，如溶解氧、温度等，pH也是重要因素之一。经科学家们的不断探索，得到亚硝酸氧化细菌最合适的条件为溶氧量1.52.0mg/L，温度2530℃，pH为7.37.5，避光生长。
在如今高密度的水产养殖模式下，由于不合理的投饵，养殖池塘长时间不清淤，养殖密度过大，工业或农业的污染[6]等原因，氮循环的动态平衡被打破，各种条件的改变，硝酸菌的失活以及高含氮的化合物的投放都会造成了亚硝酸盐的累计。亚硝酸盐在自然界中广泛存在，而当其浓度小于0.1毫克/升时，对水体中养殖的鱼类、虾类等不会产生危害；而当其浓度大于0.1毫克/升而小于0.5毫克／升时，生物就会中毒，出现鱼类进食量减少、鳃由正常颜色转变为暗紫红色、呼吸困难、游动速度明显下降、鱼群整体显得浮躁等不良现象；而当其浓度大于0.5毫克/升时，中毒现象更加明显，严重时可直接导致死亡[7]。亚硝酸盐致病（致死）的主要原因[8]是：血红蛋白是运输氧气的重要功能，而水生动物在水体中通过呼吸，使得亚硝酸盐进入血液，与血红蛋白结合形成了高铁血红蛋白，而高铁血红蛋白无法运输氧气，故而导致生物缺氧，而造成中毒症状。
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