酵母双杂交探讨ypt7和vam3与pi3k复合体亚基是否互作
:Ypt7是属于酵母小G蛋白Rab家族的一种GTP酶，Vam3是一种酵母液泡t-SNARE蛋白，这两种蛋白都参与内吞途径和细胞自噬过程，主要负责内体和自噬体与液泡的融合。为了解析这两个蛋白参与细胞自噬的可能机制，本课题着眼于探讨Ypt7和Vam3与调控细胞自噬的重要复合体PI3K复合体（包括Vps38，Vps15，Vps34，Atg6和Atg14亚基）之间是否存在直接的互作。本实验采用酵母双杂交技术，将YPT7和VAM3克隆到酵母双杂交的特定载体上，经测序、蛋白表达检测和功能验证确认所构建的质粒正确后，用于双杂交检测。结果显示，在实验的正负对照均正常显示结果的情况下，Ypt7和Vam3均不与PI3K复合体亚基互作，表明这两个蛋白不通过与PI3K的直接互作参与细胞自噬，但具体的机制仍有待于进一步探讨。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1PCR扩增目的基因 3
1.2.2重组载体的构建 4
1.2.3功能验证 6
1.2.4杂交 6
2结果与分析 7
2.1 PCR扩增目的基因 7
2.2重组载体的构建 8
2.3功能验证 11
2.4双杂交 14
3讨论 14
致谢 15
参考文献 15
附录A 培养基、常用试剂与缓冲液配方 17
附录B YPT7与VAM3的基因序列 19
酵母双杂交探讨Ypt7和Vam3与PI3K复合体亚基是否互作
引言
1.固体培养基
（1）LB培养基
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lmL, Bacto Agar 15g, dH20 1L,灭菌
（2）YPD 培养基（1L）
yeast extract 10g,Bacto Peptone 20g, Ba
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
cto Agar 20g, dH20 950ml,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入50ml 40%的葡萄糖,混匀。
（3）SDAA培养基（1L）
Bacto Agar 20g, YNB super powder 7.1g, dH2O 910ml,灭菌,加入 50ml 40%的葡萄糖,40ml25XAA,混匀。
（4）YEPG （Yeast ExtractPeptoneGlycerol）培养基（1L）
yeast extract 10g,Bacto Peptone 20g,Bacto Agar 20g,dH20 940ml,灭菌,加入 60ml50%甘油,混匀。
（5）LB+Amp 培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dH2O 1L,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入100mg/ml Amp（1000X）l ml,混勾
（6）LB+Kanr 培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dH2O 1L,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入100mg/mlKanr1000X）l ml,混勾
2.液体培养基
（1）LB培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dF^O 1L,灭菌
（2）LB+Amp 培养基（1L）
Tryptone lOg, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dHaO 1L,灭菌,待培养基温度降到60°C左右,加入lml的Amp,混匀。
（3）YPD 培养基（1L）
lxYEP950ml,40%的葡萄糖 50ml,混匀
（4）SDAA 培养基（1L）
4xYNB250ml,25XAA40ml,40%的葡萄糖 50ml, dH20 660ml,混匀
（5）lxYEP （1L）
yeast extract lOg, Bacto peptone 20g,加H2O 950ml,混匀
3、固体混合物
（1）YNB super powder
YNB （Yeast Nitrogen Base）l00 g, Magic Powder 5.85g,充分混匀,一般放旋转摇床上混匀一晚
（2）Magic Powder （1L）
Arginine 3g, Aspartic acid lOg, Cystiene 3g, Isoleucine 4.5g, Phenylalanine 7.5g, Proline3g, Serine 3g, Threonone lOg, Tryosine4.5g, Valine lOg, total 58.5g,充分混匀,放摇床上过夜摇匀
二.常用试剂
（1）4 X YNB Super （1L）
YNB super powder 28.4g,加 dH2O 溶解,定容至 1L
（2）40%的葡萄糖（1L）
葡萄糖400g,加dH20溶解,定容至1L
（3）50% 的 PEG （100ml）
PEG（Polyethylene Glycol 4000） 50g,加 dH20 溶解,定容至 100ml
（4）30%甘油（Glycerol）
30%甘油:Glycerol 30ml,加 dH20 70ml
（5）Ampicillin lOOmg/ml （1000 X）
Ampicillin l.Og, dH20 10ml,溶解,过滤除菌,20°C保存
三、缓冲液
（1）10XTAE （1L）
TrisBase 48.4g,glacial acetic acid 11.4ml,0.5M Na2EDTA（PH 8.0）,定容至 1L。
（2）10XRunning Buffer （1L）
TrisBase 30g,Glycine 144g,SDS 10g,加热溶解定容至 1L。
（3）Yeast Lysis Buffer （100ml）
5M LiCl 50ml, 1M Tris pH=8 5ml, Triton X100 4ml, 0.5M EDTA 12.5ml, dH20 28.5ml
（4）10 X DNA loading Buffer （10ml）,
10OmM EDTA 2ml, 0.05% Bromphenol 0.005g, 0.25% Xylene Cyanol 0.005g,溶解后加dH20定容至10ml
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1PCR扩增目的基因 3
1.2.2重组载体的构建 4
1.2.3功能验证 6
1.2.4杂交 6
2结果与分析 7
2.1 PCR扩增目的基因 7
2.2重组载体的构建 8
2.3功能验证 11
2.4双杂交 14
3讨论 14
致谢 15
参考文献 15
附录A 培养基、常用试剂与缓冲液配方 17
附录B YPT7与VAM3的基因序列 19
酵母双杂交探讨Ypt7和Vam3与PI3K复合体亚基是否互作
引言
1.固体培养基
（1）LB培养基
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lmL, Bacto Agar 15g, dH20 1L,灭菌
（2）YPD 培养基（1L）
yeast extract 10g,Bacto Peptone 20g, Ba
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
cto Agar 20g, dH20 950ml,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入50ml 40%的葡萄糖,混匀。
（3）SDAA培养基（1L）
Bacto Agar 20g, YNB super powder 7.1g, dH2O 910ml,灭菌,加入 50ml 40%的葡萄糖,40ml25XAA,混匀。
（4）YEPG （Yeast ExtractPeptoneGlycerol）培养基（1L）
yeast extract 10g,Bacto Peptone 20g,Bacto Agar 20g,dH20 940ml,灭菌,加入 60ml50%甘油,混匀。
（5）LB+Amp 培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dH2O 1L,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入100mg/ml Amp（1000X）l ml,混勾
（6）LB+Kanr 培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dH2O 1L,灭菌,当培养基温度降到60℃左右时加入100mg/mlKanr1000X）l ml,混勾
2.液体培养基
（1）LB培养基（1L）
Tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dF^O 1L,灭菌
（2）LB+Amp 培养基（1L）
Tryptone lOg, yeast extract 5g, NaCl 5g, IN NaOH lml, Bacto Agar 15g, dHaO 1L,灭菌,待培养基温度降到60°C左右,加入lml的Amp,混匀。
（3）YPD 培养基（1L）
lxYEP950ml,40%的葡萄糖 50ml,混匀
（4）SDAA 培养基（1L）
4xYNB250ml,25XAA40ml,40%的葡萄糖 50ml, dH20 660ml,混匀
（5）lxYEP （1L）
yeast extract lOg, Bacto peptone 20g,加H2O 950ml,混匀
3、固体混合物
（1）YNB super powder
YNB （Yeast Nitrogen Base）l00 g, Magic Powder 5.85g,充分混匀,一般放旋转摇床上混匀一晚
（2）Magic Powder （1L）
Arginine 3g, Aspartic acid lOg, Cystiene 3g, Isoleucine 4.5g, Phenylalanine 7.5g, Proline3g, Serine 3g, Threonone lOg, Tryosine4.5g, Valine lOg, total 58.5g,充分混匀,放摇床上过夜摇匀
二.常用试剂
（1）4 X YNB Super （1L）
YNB super powder 28.4g,加 dH2O 溶解,定容至 1L
（2）40%的葡萄糖（1L）
葡萄糖400g,加dH20溶解,定容至1L
（3）50% 的 PEG （100ml）
PEG（Polyethylene Glycol 4000） 50g,加 dH20 溶解,定容至 100ml
（4）30%甘油（Glycerol）
30%甘油:Glycerol 30ml,加 dH20 70ml
（5）Ampicillin lOOmg/ml （1000 X）
Ampicillin l.Og, dH20 10ml,溶解,过滤除菌,20°C保存
三、缓冲液
（1）10XTAE （1L）
TrisBase 48.4g,glacial acetic acid 11.4ml,0.5M Na2EDTA（PH 8.0）,定容至 1L。
（2）10XRunning Buffer （1L）
TrisBase 30g,Glycine 144g,SDS 10g,加热溶解定容至 1L。
（3）Yeast Lysis Buffer （100ml）
5M LiCl 50ml, 1M Tris pH=8 5ml, Triton X100 4ml, 0.5M EDTA 12.5ml, dH20 28.5ml
（4）10 X DNA loading Buffer （10ml）,
10OmM EDTA 2ml, 0.05% Bromphenol 0.005g, 0.25% Xylene Cyanol 0.005g,溶解后加dH20定容至10ml
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