用酵母双杂交探讨hops专一性亚基与细胞自噬蛋白的互作(附件)
：自噬是将胞内大分子物质通过自噬体运送到溶酶体中降解成小分子进行重新利用的途径。HOPS复合体专一性亚基缺失影响自噬体与溶酶体及内体与溶酶体的融合。HOPS复合体由六个亚基Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39、Vps41构成，其中前四个亚基也是CORVET复合体的组成成分，只有Vps39和Vps41是HOPS复合体的专一性亚基。酵母双杂交是一种分析蛋白与蛋白相互作用非常有效的方法。为了探讨HOPS复合体参与细胞自噬的机制，本论文通过酵母双杂交来检测Vps39和Vps41与一些调控自噬相关的蛋白是否有相互作用。研究结果发现，所构建的酵母双杂交质粒能恢复其相应突变体中的自噬缺陷来正确行使其功能，其中Vps41与PI3K复合体亚基Vps15有较强互作，而Vps39除与Vps15有较强互作之外，还与Atg17有较强互作，说明HOPS复合体可能通过其专一性亚基与自噬蛋白互作来调控自噬。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论） 1
1 材料与方法 2
1.1 菌株和质粒 2
1.2 仪器与试剂 2
1.3 培养基 3
1.4 方法 3
1.4.1 PCR扩增目的基因 3
1.4.2 构建重组质粒 4
1.4.3电转化 4
1.4.4 菌落PCR 4
1.4.5 重组质粒验证 5
1.4.6 酵母转化 5
1.4.7 功能验证 6
1.4.8 酵母双杂交 6
2 结果与分析 6
2.1 质粒重组 6
2.1.1 重组质粒的获得 6
2.1.2 重组质粒验证 8
2.2 功能验证 9
2.3 酵母双杂交 11
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 12
附录A 14
附录B 16
附录C 19
用酵母双杂交探讨HOPS专一性亚基与细胞自噬蛋白的互作
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
引言：自噬是将胞内大分子物质通过自噬体运送到溶酶体中降解成小分子进行重新利用的途径，可以帮助细胞适应外界环境，合理利用胞内资源。宏自噬是酵母中较为主要的一种自噬方式，在饥饿处理的条件下，宏自噬可以被激活。在酵母当中，酵母的液泡等同于哺乳动物的溶酶体系统[1，2]。
HOPS（homotypic vacuole fusion protein sorting）复合体的功能主要是控制自噬体与溶酶体及内体与溶酶体的融合。HOPS复合体由Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41六个亚基构成，CORVET复合体与HOPS复合体非常相似，也是由六个亚基构成[3，4]。这两个复合体分享了4个Class C亚基：Vps11、Vps16、Vps18和Vps33[5]。Vps39和Vps41则是HOPS复合体的专一性亚基，位于HOPS复合体的两端，主要与小G蛋白Ypt7发生互作。已有文献明确报道Vps39和Vps41缺失后GFPAtg8不能与液泡融合而大量积累[6]。
在细胞自噬当中主要有两条调控通路：TOR通路和PI3K通路。Vps30/Atg6、Atg14、Vps34和Vps38是PI3K复合体当中的组成成分，Vps15作为一种蛋白激酶，是Vps34的调节亚基。Atg8是一种泛素样蛋白，同PE连接，控制原自噬体的扩伸。Atg10是类似E2的连接酶使得Atg5与Atg12连接。Atg17是Atg1复合体的亚基，参与PAS蛋白的募集[7]。这些蛋白在细胞自噬过程中有非常重要的作用。
酵母双杂交系统利用的是转录激活因子具有两个模块，分别为DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），当要检测的两个蛋白分别与AD和BD形成两个融合蛋白后，如果两个蛋白具有互作，就可以使AD和BD形成转录激活因子激活报道基因，这里使用的报道基因为HIS基因。酵母双杂交系统作为一种分析蛋白与蛋白相互作用非常有效的方法，在蛋白质间相互作用的研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等很多方面发挥着重要的作用[8，9，10]。本文将采用该方法探讨HOPS复合体专一性亚基与一些自噬蛋白的互作情况来阐释HOPS复合体在细胞自噬中的功能。
1材料与方法
1．1菌株和质粒
表1.菌株和质粒
A.菌株
菌株
Strain
别名
Alias
基因型
Genotype
参考文献
Reference
YHY2422
WT
SEY6210, GTPAtg8
本实验室
YHY3735
vps39?
YHY2422, vps39::Kan MX
本实验室
YHY3994
vps41?
YHY2422, vps41::Hyg
本实验室
YHY2569
Y187
Y187 Mata ura352, his3200, ade2101, trp1901, leu23, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3::GAL1UASGAL1TATAlacZ
本实验室
YHY4453
Y187+pGADT7
本实验室
YHY6905
Y187+ pGADT7VPS39
本研究
YHY6907
Y187+ pGADT7VPS41
本研究
YHY3238
Y2Hgold
Y2HGold Mata trp1 leu2 ura3 his3 gal4?D
本实验室
YHY6433
Y2HGold+pGBKT7
本实验室
YHY6417
Y2HGold+pGBKT7VPS38
本实验室
YHY6298
Y2HGold+pGBKT7VPS15
本实验室
YHY4958
Y2HGold+pGBKT7VPS34
本实验室
YHY5071
Y2HGold+pGBKT7ATG6
本实验室
YHY5074
Y2HGold+pGBKT7ATG14
本实验室
YHY6782
Y2HGold+pGBKT7ATG8
本实验室
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论） 1
1 材料与方法 2
1.1 菌株和质粒 2
1.2 仪器与试剂 2
1.3 培养基 3
1.4 方法 3
1.4.1 PCR扩增目的基因 3
1.4.2 构建重组质粒 4
1.4.3电转化 4
1.4.4 菌落PCR 4
1.4.5 重组质粒验证 5
1.4.6 酵母转化 5
1.4.7 功能验证 6
1.4.8 酵母双杂交 6
2 结果与分析 6
2.1 质粒重组 6
2.1.1 重组质粒的获得 6
2.1.2 重组质粒验证 8
2.2 功能验证 9
2.3 酵母双杂交 11
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 12
附录A 14
附录B 16
附录C 19
用酵母双杂交探讨HOPS专一性亚基与细胞自噬蛋白的互作
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
引言：自噬是将胞内大分子物质通过自噬体运送到溶酶体中降解成小分子进行重新利用的途径，可以帮助细胞适应外界环境，合理利用胞内资源。宏自噬是酵母中较为主要的一种自噬方式，在饥饿处理的条件下，宏自噬可以被激活。在酵母当中，酵母的液泡等同于哺乳动物的溶酶体系统[1，2]。
HOPS（homotypic vacuole fusion protein sorting）复合体的功能主要是控制自噬体与溶酶体及内体与溶酶体的融合。HOPS复合体由Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41六个亚基构成，CORVET复合体与HOPS复合体非常相似，也是由六个亚基构成[3，4]。这两个复合体分享了4个Class C亚基：Vps11、Vps16、Vps18和Vps33[5]。Vps39和Vps41则是HOPS复合体的专一性亚基，位于HOPS复合体的两端，主要与小G蛋白Ypt7发生互作。已有文献明确报道Vps39和Vps41缺失后GFPAtg8不能与液泡融合而大量积累[6]。
在细胞自噬当中主要有两条调控通路：TOR通路和PI3K通路。Vps30/Atg6、Atg14、Vps34和Vps38是PI3K复合体当中的组成成分，Vps15作为一种蛋白激酶，是Vps34的调节亚基。Atg8是一种泛素样蛋白，同PE连接，控制原自噬体的扩伸。Atg10是类似E2的连接酶使得Atg5与Atg12连接。Atg17是Atg1复合体的亚基，参与PAS蛋白的募集[7]。这些蛋白在细胞自噬过程中有非常重要的作用。
酵母双杂交系统利用的是转录激活因子具有两个模块，分别为DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），当要检测的两个蛋白分别与AD和BD形成两个融合蛋白后，如果两个蛋白具有互作，就可以使AD和BD形成转录激活因子激活报道基因，这里使用的报道基因为HIS基因。酵母双杂交系统作为一种分析蛋白与蛋白相互作用非常有效的方法，在蛋白质间相互作用的研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等很多方面发挥着重要的作用[8，9，10]。本文将采用该方法探讨HOPS复合体专一性亚基与一些自噬蛋白的互作情况来阐释HOPS复合体在细胞自噬中的功能。
1材料与方法
1．1菌株和质粒
表1.菌株和质粒
A.菌株
菌株
Strain
别名
Alias
基因型
Genotype
参考文献
Reference
YHY2422
WT
SEY6210, GTPAtg8
本实验室
YHY3735
vps39?
YHY2422, vps39::Kan MX
本实验室
YHY3994
vps41?
YHY2422, vps41::Hyg
本实验室
YHY2569
Y187
Y187 Mata ura352, his3200, ade2101, trp1901, leu23, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3::GAL1UASGAL1TATAlacZ
本实验室
YHY4453
Y187+pGADT7
本实验室
YHY6905
Y187+ pGADT7VPS39
本研究
YHY6907
Y187+ pGADT7VPS41
本研究
YHY3238
Y2Hgold
Y2HGold Mata trp1 leu2 ura3 his3 gal4?D
本实验室
YHY6433
Y2HGold+pGBKT7
本实验室
YHY6417
Y2HGold+pGBKT7VPS38
本实验室
YHY6298
Y2HGold+pGBKT7VPS15
本实验室
YHY4958
Y2HGold+pGBKT7VPS34
本实验室
YHY5071
Y2HGold+pGBKT7ATG6
本实验室
YHY5074
Y2HGold+pGBKT7ATG14
本实验室
YHY6782
Y2HGold+pGBKT7ATG8
本实验室
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