利用crispr系统构建灵芝基因敲除载体(附件)
作为一种近年来引起广泛关注的基因组编辑技术，CRISPR/Cas系统能够高效、定向的编辑靶基因，这为目标基因的功能研究提供了帮助。CRISPR/Cas系统是细菌和古菌中用来抵御外源病毒和质粒的入侵而形成的“免疫机制”，人们将该系统修饰成人工核酸内切酶用于基因编辑，在大鼠，拟南芥，大肠杆菌，斑马鱼等物种都成功运用，但在灵芝中尚未有相关报道。本实验以灵芝G20为研究对象，成功克隆出灵芝U6启动子。ura3基因编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，若该酶失活，除非在加入尿嘧啶或尿苷的培养基中，否则灵芝则无法生长。根据这一特性便于在灵芝中定向筛选，本文选择ura3基因作为基因编辑的目标靶点，通过ura3基因的筛选作用成功验证该系统的成功导入并发挥作用，即成功构建灵芝CRISPR载体。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
引言 3
1 材料与方法 5
1．1 材料 5
1．1．1 供试菌株 5
1. 1. 2 培养基 5
1．1．3 主要试剂与溶液 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．2 方法 5
1. 2. 1 U6启动子的克隆 5
1. 2. 1. 1 提取菌丝体基因组DNA 5
1. 2. 1. 2 基因的克隆 6
1. 2. 1. 3 构建克隆载体 6
1. 2. 1. 4 DNA序列的测定 7
1. 2. 2 构建灵芝CRISRP载体 7
1. 2. 2. 1 sgRNA的设计 7
1. 2. 2. 2 CRISPR载体的构建 7
2 结果与分析 8
2．1 U6启动子的克隆 8
2．1．1 U6启动子引物设计 8
2．1．2 灵芝菌丝体中总DNA提取 8
2．1．3 PCR扩增产物电泳检测 9
2．1．4 菌落PCR电泳检测 9
2．1．5 质粒电泳检测 10
2. 1. 6 测序 10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2．2 构建载体 10
2. 2. 1 酶切构巢曲霉CRISRP质粒 10
2. 2. 2 连接U6启动子序列与sgRNA序列 11
2. 2. 3 构建灵芝CRISPR载体 11
3 讨论 12
参考文献 13
附录一 15
利用CRISPR系统构建灵芝基因敲除载体
生物基地 章钰婷
引言
灵芝（Ganoderma lucidum），外形呈伞状，菌盖肾形、半圆或近圆形，为多孔菌科灵芝属。在我国，其药用历史已有2000多年，是一种名贵的传统中药材，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。灵芝含有三萜类、多糖、甾醇、生物碱、氨基酸等多种化学成分，具有抗衰老、调节免疫、抗肿瘤、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性，故此灵芝的药用价值开发是当今药用菌研究的一个前沿和热点。灵芝三萜化合物与灵芝多糖是灵芝的主要药用成分。故此其生物合成的调控机制的研究也十分重要。
基因敲除(knockout) 是研究基因调控机制和代谢通路常用的一种技术手段。基因敲除：一种基因修饰技术，针对目的基因，通过基因改造，令特定基因丧失某些功能，进而研究该基因对相关表型造成的改变，从而预测该基因的生物学功能。
近年来常用的基因组定点编辑技术运用以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(Zincfinger nucleases, ZFNs), TALE 核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs),及近年来兴起的一项新技术——Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPRassociated (Cas)9 系统。这些人工核酸酶都可以特定DNA作为目标靶点，进行对DNA特定位点的剪切。ZFN和TALEN分别通过锌指蛋白和类转录激活因子效应物识别DNA序列，并在特定位点对DNA进行切割，产生双链断裂（Double strandbreaks, DSBs），随后在非同源末端连接修复机制下随机形成多个碱基的插入或删除，从而实现基因敲除。然而ZFNs 和 TALENs 这两项技术在操作中技术难度较大、构建组装时间较长, 一般实验室很难有效利用。而CRISPR拥有简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，在实验室易于推广使用。
2006年，美国国立卫生研究院的研究人员通过生物信息分析预测，CRISPR系统可能存在类似真核生物的RNAi方式的“免疫功能”［1］。外源DNA入侵含有CRISPR系统的细菌时,宿主体内的CRISPR相关蛋白质复合体会迅速与外源DNA结合，将其切割成小片段核酸，再在相关蛋白的作用下，将其中的1个小片段整合至前导区与第1个重复之间，从而形成1个新的间区。当同种噬菌体再次进入该细菌时，CRISPR位点的转录水平迅速上升［2］。研究表明［3］，CRISPR转录生成前体precrRNA（包含重复序列和间区）,之后被Cas蛋白剪切成一小段成熟crRNA,包含1个间隔序列和部分重复序列［4,5］。成熟crRNA与Cas9蛋白质形成具有特殊功能的复合物crRNP[6]。crRNP将会在crRNA的介导下寻找与其互补的DNA片段，并特异性的结合。然后在Cas9 的作用下,将外源 DNA降解，从而达到保护宿主的目的。（如图一）
图一：CRISPR/CAS 系统基因敲除技术
使用Ⅱ型 CRISPR/Cas 系统的基因编辑技术已经成功应用于大肠杆菌[7]、肺炎双球菌[7]、酿酒酵母[8]、斑马鱼[9]、小鼠细胞[10]、小鼠[11,12]、人类多种细胞系[13]、果蝇[14]、线虫[15]、大鼠[16]、水稻[17,18]、小麦[17]、拟南芥[18,19]以及本生烟[19,20]中。但在灵芝中，还未找到高效的基因敲除手段。
乳清酸核苷5’单磷酸脱羧酶基因（ura3基因）是酵母V号染色体上的一个基因，该基因可以编码乳清苷5磷酸脱羧酶，该酶失活，则细胞就无法生长，除非在加入尿苷或尿嘧啶的培养基中。将ura3基因转化进营养缺陷菌株中，它们便可以正常生长（阳性选择）。而若在培养基中加入5FOA（5氟乳清酸），正常原养型细胞中的乳清苷5磷酸脱羧酶可将5FOA转化成有毒化合物，产物5氟尿嘧啶能够导致细胞死亡（阴性选择）。
我们可以利用ura3基因的这一特性来筛选突变体。sgRNA和Cas9 装载在载体上，导入灵芝中，导入的CRISPR/Cas系统识别并降解靶基因 ura3基因，通过双重标志判断突变体：而缺失ura3基因的细胞只有在加入尿苷或尿嘧啶的培养基中才可生长；由于缺失ura3基因，所以加入5FOA并不会产生有毒物质，细胞正常生长。
利用CRISPR系统建立灵芝基因敲除体系。该体系不仅在研究灵芝基因功能方面具有应用前景，同时也为今后进一步培育灵芝三萜高产菌株奠定基础。此外，该技术的成功应用为进一步揭示灵芝三萜生物合成的调控机制积累了资料，具有十分重要的理论意义。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
引言 3
1 材料与方法 5
1．1 材料 5
1．1．1 供试菌株 5
1. 1. 2 培养基 5
1．1．3 主要试剂与溶液 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．2 方法 5
1. 2. 1 U6启动子的克隆 5
1. 2. 1. 1 提取菌丝体基因组DNA 5
1. 2. 1. 2 基因的克隆 6
1. 2. 1. 3 构建克隆载体 6
1. 2. 1. 4 DNA序列的测定 7
1. 2. 2 构建灵芝CRISRP载体 7
1. 2. 2. 1 sgRNA的设计 7
1. 2. 2. 2 CRISPR载体的构建 7
2 结果与分析 8
2．1 U6启动子的克隆 8
2．1．1 U6启动子引物设计 8
2．1．2 灵芝菌丝体中总DNA提取 8
2．1．3 PCR扩增产物电泳检测 9
2．1．4 菌落PCR电泳检测 9
2．1．5 质粒电泳检测 10
2. 1. 6 测序 10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2．2 构建载体 10
2. 2. 1 酶切构巢曲霉CRISRP质粒 10
2. 2. 2 连接U6启动子序列与sgRNA序列 11
2. 2. 3 构建灵芝CRISPR载体 11
3 讨论 12
参考文献 13
附录一 15
利用CRISPR系统构建灵芝基因敲除载体
生物基地 章钰婷
引言
灵芝（Ganoderma lucidum），外形呈伞状，菌盖肾形、半圆或近圆形，为多孔菌科灵芝属。在我国，其药用历史已有2000多年，是一种名贵的传统中药材，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。灵芝含有三萜类、多糖、甾醇、生物碱、氨基酸等多种化学成分，具有抗衰老、调节免疫、抗肿瘤、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性，故此灵芝的药用价值开发是当今药用菌研究的一个前沿和热点。灵芝三萜化合物与灵芝多糖是灵芝的主要药用成分。故此其生物合成的调控机制的研究也十分重要。
基因敲除(knockout) 是研究基因调控机制和代谢通路常用的一种技术手段。基因敲除：一种基因修饰技术，针对目的基因，通过基因改造，令特定基因丧失某些功能，进而研究该基因对相关表型造成的改变，从而预测该基因的生物学功能。
近年来常用的基因组定点编辑技术运用以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(Zincfinger nucleases, ZFNs), TALE 核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs),及近年来兴起的一项新技术——Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPRassociated (Cas)9 系统。这些人工核酸酶都可以特定DNA作为目标靶点，进行对DNA特定位点的剪切。ZFN和TALEN分别通过锌指蛋白和类转录激活因子效应物识别DNA序列，并在特定位点对DNA进行切割，产生双链断裂（Double strandbreaks, DSBs），随后在非同源末端连接修复机制下随机形成多个碱基的插入或删除，从而实现基因敲除。然而ZFNs 和 TALENs 这两项技术在操作中技术难度较大、构建组装时间较长, 一般实验室很难有效利用。而CRISPR拥有简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，在实验室易于推广使用。
2006年，美国国立卫生研究院的研究人员通过生物信息分析预测，CRISPR系统可能存在类似真核生物的RNAi方式的“免疫功能”［1］。外源DNA入侵含有CRISPR系统的细菌时,宿主体内的CRISPR相关蛋白质复合体会迅速与外源DNA结合，将其切割成小片段核酸，再在相关蛋白的作用下，将其中的1个小片段整合至前导区与第1个重复之间，从而形成1个新的间区。当同种噬菌体再次进入该细菌时，CRISPR位点的转录水平迅速上升［2］。研究表明［3］，CRISPR转录生成前体precrRNA（包含重复序列和间区）,之后被Cas蛋白剪切成一小段成熟crRNA,包含1个间隔序列和部分重复序列［4,5］。成熟crRNA与Cas9蛋白质形成具有特殊功能的复合物crRNP[6]。crRNP将会在crRNA的介导下寻找与其互补的DNA片段，并特异性的结合。然后在Cas9 的作用下,将外源 DNA降解，从而达到保护宿主的目的。（如图一）
图一：CRISPR/CAS 系统基因敲除技术
使用Ⅱ型 CRISPR/Cas 系统的基因编辑技术已经成功应用于大肠杆菌[7]、肺炎双球菌[7]、酿酒酵母[8]、斑马鱼[9]、小鼠细胞[10]、小鼠[11,12]、人类多种细胞系[13]、果蝇[14]、线虫[15]、大鼠[16]、水稻[17,18]、小麦[17]、拟南芥[18,19]以及本生烟[19,20]中。但在灵芝中，还未找到高效的基因敲除手段。
乳清酸核苷5’单磷酸脱羧酶基因（ura3基因）是酵母V号染色体上的一个基因，该基因可以编码乳清苷5磷酸脱羧酶，该酶失活，则细胞就无法生长，除非在加入尿苷或尿嘧啶的培养基中。将ura3基因转化进营养缺陷菌株中，它们便可以正常生长（阳性选择）。而若在培养基中加入5FOA（5氟乳清酸），正常原养型细胞中的乳清苷5磷酸脱羧酶可将5FOA转化成有毒化合物，产物5氟尿嘧啶能够导致细胞死亡（阴性选择）。
我们可以利用ura3基因的这一特性来筛选突变体。sgRNA和Cas9 装载在载体上，导入灵芝中，导入的CRISPR/Cas系统识别并降解靶基因 ura3基因，通过双重标志判断突变体：而缺失ura3基因的细胞只有在加入尿苷或尿嘧啶的培养基中才可生长；由于缺失ura3基因，所以加入5FOA并不会产生有毒物质，细胞正常生长。
利用CRISPR系统建立灵芝基因敲除体系。该体系不仅在研究灵芝基因功能方面具有应用前景，同时也为今后进一步培育灵芝三萜高产菌株奠定基础。此外，该技术的成功应用为进一步揭示灵芝三萜生物合成的调控机制积累了资料，具有十分重要的理论意义。
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