沙雷氏菌胞外蛋白酶的基因突变对灵菌红素合成的影响
：灵菌红素(Prodigiosin)是一类具有众多生物活性的次生代谢产物，由粘质沙雷氏菌、某些放线菌和一些其他的革兰氏阴性菌产生。为研究沙雷氏菌胞外蛋白酶的基因突变对灵菌红素合成的影响，本研究采用分光光度法对野生型菌株和蛋白酶基因突变菌株在不同发酵培养基上的生长曲线和灵菌红素产量进行了测定。结果表明，突变株的生长在本研究所采用的发酵培养基上差异不大，但突变菌株产灵菌红素的能力与野生株存在差异，差异产生的原因有待进一步研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌种2
1.1.2 主要仪器与试剂2
1.1.3 培养基2
1.2 方法2
1.2.1 菌种活化2
1.2.2 种子培养2
1.2.3 发酵培养2
1.2.4 生长曲线的测定2
1.2.5 不同生长时间下灵菌红素的测定2
2 结果与分析3
2.1 菌株FS14和50KD在发酵培养基中的生长曲线3
2.2 菌株FS14和50KD在发酵培养基中的灵菌红素产量5
3 结论8
致谢8
参考文献9
沙雷氏菌胞外蛋白酶的基因突变对灵菌红素合成的影响
引言
灵菌红素族色素(Prodiginines)是一类含有三吡咯结构的天然红色素家族的总称，有四大结构类型，包括prodigiosin和undecylprodigiosin、Butylmetacycloheptylprodiginine、Cycloprodigiosin、Cyclononylprodigiosin[1]。灵菌红素及其衍生物作为一类典型的次生代谢产物，其产生菌主要有粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)等。
灵菌红素及其衍生物具有多种生物活性，如抗菌、抗真菌、抗原虫、抗疟、免疫抑制和抗癌活性[23]。近年来，其抗癌活性引起人们
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
的极大关注；作为一种极具开发潜力的抗癌药物，灵菌红素及其衍生物能诱导多种癌细胞凋亡，而对非恶性细胞系的影响不大；目前，灵菌红素衍生物obatoclax mesylate作为一种Bcl2抑制剂，己进入多种癌症的临床I/II期研究[4]。此外，灵菌红素具有细胞溶解酶活性，可作为除藻剂应用于水华和赤潮等环境污染的治理中[5]。
粘质沙雷氏菌灵菌红素的生物合成以脯氨酸为底物，整个途径分两大步，分别是2methyl3pentylepyrrole (MAP)的合成和4methoxy2,2’bipyrrole5carbaldehyde(MBC)的合成，然后这两种产物再经缩合成完整的灵菌红素[1]。
目前灵菌红素主要由微生物发酵生产。灵菌红素的生产研究主要集中在对培养基成分的优化上。有些研究集中在各种培养条件如温度、pH、溶解氧水平、光等因素的影响[6]。而添加不同营养成分如铁酸、磷酸盐、ATP、氨基酸[7]的影响也被考察。
除了个别菌株外，灵菌红素的产量现阶段普遍不高，难以进行工业化生产。李子武等以蔗糖和牛肉膏为底物，发酵灵菌红素达到4.139g/L，为国内较高水平[8]。Giri等以花生粉为底物，获得粘质沙雷菌产灵菌红素的最高产量38.75g/L[9]。Helvia等利用木薯废液和甘露醇发酵产灵菌红素达到49.5g/L水平[10]。
本实验室从病害白术茎秆部位分离得到一株沙雷氏菌，前期研究发现，该菌的胞外蛋白酶基因突变株的颜色与野生株的颜色不同，这意味着灵菌红素的产量不同。本研究拟对突变型菌株和野生型菌株在不同培养基中合成灵菌红素的产量进行测定及比较，从而初步了解胞外蛋白酶是通过哪些方面调节灵菌红素的合成的。
材料与方法
材料
菌种
沙雷氏菌Serratia sp. FS14及其胞外蛋白酶突变株Serratia 50KD，由本实验室保存。
主要仪器与试剂
恒温摇床（THZC，太仓市华美生化仪器厂）；
电热恒温培养箱（GSP9050MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；
超净台（SWCJ18U，苏州安泰空气技术有限公司）；
紫外可见光分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；
高速冷冻离心机（SORVALL RC 6+，Thermo Electron Corporation）；
立式电热压力蒸汽灭菌锅（LSB50L，上海华线医用核子仪器有限公司）；
胰蛋白胨、酵母粉提取物、蛋白胨、琼脂等均为生化试剂；甘油、乙醇、NaCl、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3等购自上海生工生物工程有限公司，均为分析纯。
培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L。
发酵培养基[11]：甘油10ml/L，在此基础上分别添加1% NH4NO3、1% NH4Cl、1% NaNO3、1%蛋白胨或1.5%蛋白胨，pH 7.0。
方法
菌种活化
取所保存的菌种，用接种环挑取单菌落，划线接种于LB固体培养基上，在恒温培养箱中37℃培养24h。
种子培养
取培养后的平板，用无菌牙签挑取一定量单菌落，接种于装有3ml LB液体培养基的5ml培养管中，28℃，200r/min振荡培养24h作为种子液。
发酵培养
取种子液按2%接种量转接到装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，200r/min振荡培养。为保证实验的准确性，每种培养基均设置三个重复。
生长曲线的测定
采用分光光度法测定生长曲线。间隔一定时间取适量发酵液稀释，以未接种的发酵培养基等量稀释作为空白对照，测定600nm处的吸光值，根据吸光值和取样时间绘制菌株在各培养基的生长曲线。
不同生长时间下灵菌红素的测定
灵菌红素在535nm处有特征吸收峰，并随溶液pH的变化而偏移[12]，可利用此特征通过分光光度法测定灵菌红素的产量。将灵菌红素溶解后做全波长扫描，根据扫描结果选取536nm作为本实验的检测波长。
灵菌红素为脂溶性色素，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，几乎不溶于水。本实验使用酸性乙醇对菌体进行破壁和色素的萃取。
间隔一定时间取发酵液0.5ml，加入4.5ml 60%乙醇(pH 2.0)，28℃，200r/min振荡培养20min，取2ml以12000rpm离心10min，取上清液，以60%乙醇(pH 2.0)作等量适当稀释后作为空白对照，测定536nm处的吸光值。由于本实验没分离纯化灵菌红素制作标准曲线，所以以OD536表示灵菌红素的相对产量，绘制灵菌红素产量随时间变化的曲线。
结果与分析
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌种2
1.1.2 主要仪器与试剂2
1.1.3 培养基2
1.2 方法2
1.2.1 菌种活化2
1.2.2 种子培养2
1.2.3 发酵培养2
1.2.4 生长曲线的测定2
1.2.5 不同生长时间下灵菌红素的测定2
2 结果与分析3
2.1 菌株FS14和50KD在发酵培养基中的生长曲线3
2.2 菌株FS14和50KD在发酵培养基中的灵菌红素产量5
3 结论8
致谢8
参考文献9
沙雷氏菌胞外蛋白酶的基因突变对灵菌红素合成的影响
引言
灵菌红素族色素(Prodiginines)是一类含有三吡咯结构的天然红色素家族的总称，有四大结构类型，包括prodigiosin和undecylprodigiosin、Butylmetacycloheptylprodiginine、Cycloprodigiosin、Cyclononylprodigiosin[1]。灵菌红素及其衍生物作为一类典型的次生代谢产物，其产生菌主要有粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)等。
灵菌红素及其衍生物具有多种生物活性，如抗菌、抗真菌、抗原虫、抗疟、免疫抑制和抗癌活性[23]。近年来，其抗癌活性引起人们
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
的极大关注；作为一种极具开发潜力的抗癌药物，灵菌红素及其衍生物能诱导多种癌细胞凋亡，而对非恶性细胞系的影响不大；目前，灵菌红素衍生物obatoclax mesylate作为一种Bcl2抑制剂，己进入多种癌症的临床I/II期研究[4]。此外，灵菌红素具有细胞溶解酶活性，可作为除藻剂应用于水华和赤潮等环境污染的治理中[5]。
粘质沙雷氏菌灵菌红素的生物合成以脯氨酸为底物，整个途径分两大步，分别是2methyl3pentylepyrrole (MAP)的合成和4methoxy2,2’bipyrrole5carbaldehyde(MBC)的合成，然后这两种产物再经缩合成完整的灵菌红素[1]。
目前灵菌红素主要由微生物发酵生产。灵菌红素的生产研究主要集中在对培养基成分的优化上。有些研究集中在各种培养条件如温度、pH、溶解氧水平、光等因素的影响[6]。而添加不同营养成分如铁酸、磷酸盐、ATP、氨基酸[7]的影响也被考察。
除了个别菌株外，灵菌红素的产量现阶段普遍不高，难以进行工业化生产。李子武等以蔗糖和牛肉膏为底物，发酵灵菌红素达到4.139g/L，为国内较高水平[8]。Giri等以花生粉为底物，获得粘质沙雷菌产灵菌红素的最高产量38.75g/L[9]。Helvia等利用木薯废液和甘露醇发酵产灵菌红素达到49.5g/L水平[10]。
本实验室从病害白术茎秆部位分离得到一株沙雷氏菌，前期研究发现，该菌的胞外蛋白酶基因突变株的颜色与野生株的颜色不同，这意味着灵菌红素的产量不同。本研究拟对突变型菌株和野生型菌株在不同培养基中合成灵菌红素的产量进行测定及比较，从而初步了解胞外蛋白酶是通过哪些方面调节灵菌红素的合成的。
材料与方法
材料
菌种
沙雷氏菌Serratia sp. FS14及其胞外蛋白酶突变株Serratia 50KD，由本实验室保存。
主要仪器与试剂
恒温摇床（THZC，太仓市华美生化仪器厂）；
电热恒温培养箱（GSP9050MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；
超净台（SWCJ18U，苏州安泰空气技术有限公司）；
紫外可见光分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；
高速冷冻离心机（SORVALL RC 6+，Thermo Electron Corporation）；
立式电热压力蒸汽灭菌锅（LSB50L，上海华线医用核子仪器有限公司）；
胰蛋白胨、酵母粉提取物、蛋白胨、琼脂等均为生化试剂；甘油、乙醇、NaCl、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3等购自上海生工生物工程有限公司，均为分析纯。
培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L。
发酵培养基[11]：甘油10ml/L，在此基础上分别添加1% NH4NO3、1% NH4Cl、1% NaNO3、1%蛋白胨或1.5%蛋白胨，pH 7.0。
方法
菌种活化
取所保存的菌种，用接种环挑取单菌落，划线接种于LB固体培养基上，在恒温培养箱中37℃培养24h。
种子培养
取培养后的平板，用无菌牙签挑取一定量单菌落，接种于装有3ml LB液体培养基的5ml培养管中，28℃，200r/min振荡培养24h作为种子液。
发酵培养
取种子液按2%接种量转接到装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，200r/min振荡培养。为保证实验的准确性，每种培养基均设置三个重复。
生长曲线的测定
采用分光光度法测定生长曲线。间隔一定时间取适量发酵液稀释，以未接种的发酵培养基等量稀释作为空白对照，测定600nm处的吸光值，根据吸光值和取样时间绘制菌株在各培养基的生长曲线。
不同生长时间下灵菌红素的测定
灵菌红素在535nm处有特征吸收峰，并随溶液pH的变化而偏移[12]，可利用此特征通过分光光度法测定灵菌红素的产量。将灵菌红素溶解后做全波长扫描，根据扫描结果选取536nm作为本实验的检测波长。
灵菌红素为脂溶性色素，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，几乎不溶于水。本实验使用酸性乙醇对菌体进行破壁和色素的萃取。
间隔一定时间取发酵液0.5ml，加入4.5ml 60%乙醇(pH 2.0)，28℃，200r/min振荡培养20min，取2ml以12000rpm离心10min，取上清液，以60%乙醇(pH 2.0)作等量适当稀释后作为空白对照，测定536nm处的吸光值。由于本实验没分离纯化灵菌红素制作标准曲线，所以以OD536表示灵菌红素的相对产量，绘制灵菌红素产量随时间变化的曲线。
结果与分析
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/351.html
