PA蛋白多克隆抗体的制备
PA蛋白多克隆抗体的制备[20200614171702]
摘要：本试验旨在获得PA蛋白的多克隆抗体。首先将实验室已获得的PA蛋白序列进行优化；然后将优化基因片段克隆到原核表达载体pQZ上，构建重组质粒pQZ-PA，转化大肠杆菌BL21（DE3），进行蛋白表达；获得的PA蛋白经GEM颗粒一步纯化后免疫新西兰兔，四免后收集血清，用琼脂扩散的方法检测抗体效价，并用PA相关融合蛋白进行Western-blot鉴定。结果表明，PA蛋白在重组大肠杆菌中可溶性表达，免疫原性较好，血清琼扩效价可以达到1:4，Western-blot鉴定显示特异性良好。本研究成功获得的PA蛋白多克隆抗体，为PA蛋白的相关研究奠定基础。
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关键字:原核表达；PA蛋白；多克隆抗体
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法5
1.2.1获取PA蛋白5
1.2.2免疫家兔8
1.2.3 血清制备8
1.2.4琼脂扩散检测8
1.2.5Western Blot检测7
2结果9
2.1血清采集9
2.2 目的片段酶切结果 10
2.3 表达载体鉴定结果 10
2.4 表达及可溶性分析结果10
2.5 Western-Blot结果 11
2.6 琼脂扩散结果 12
3讨论12
致谢14
参考文献14
PA蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
引言
GEM表面展示系统是国外近年发展起来的一种抗原制备新技术。该技术包括GEM颗粒（Gram-positive bacterial enhancer matrix particles）和蛋白锚钩（Protein anchor, PA）两个构件。蛋白锚钩PA是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的一个结构域，可以非共价方式与GEM颗粒结合，与PA融合表达的目标蛋白可以展示在GEM颗粒表面，表明PA蛋白是GEM表面展示系统中的核心部件。[1]若能制备出锚钩蛋白PA的多克隆抗体，则可以在今后的研究中，进行与锚钩蛋白PA融合的目的蛋白的鉴定、目的蛋白与GEM结合效率评价等研究。[2]
大肠杆菌原核表达技术因其遗传背景清楚、操作简单方便、表达量高、成本低[3]而得到普遍应用，但是该系统表达的蛋白常因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
表达过快来不及正确折叠，或系统缺少促进蛋白正确折叠表达常以无活性的包涵体形式存在。[4]因此，实际工作中优化表达条件得到可溶性蛋白尤为重要。
本试验首先应用原核表达载体表达PA蛋白，然后经GEM颗粒一步纯化后免疫新西兰兔，多次免疫后收集血清，用琼脂扩散的方法检测抗体效价。本研究旨在成功获得的PA蛋白多克隆抗体，为PA蛋白的相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与载体
菌种：大肠杆菌BL-21（DE3）和DH5α、乳酸乳球菌MG1363
载体：原核表达载体pET-32a（+）
1.1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶：Nde I 、Hind III
购自大连TaKaRa公司的有：质粒提取试剂盒；Mini BEST 胶回收试剂盒；PCR 反应所需的Ex Taq酶、ＲTaq酶、dNTP、Ex Taq buffer、PCR buffer、镁离子；pMD18-T 载体;DNA连接酶；琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE凝胶电泳Marker 与buffer。
弗氏不完全佐剂：液体石蜡和羊毛脂的比例混合物。
弗氏完全佐剂：弗氏不完全佐剂加卡介苗或死的结核分枝杆菌。
其他试剂均为国产分析纯或实验室自制。
1.1.3 实验器材
SW-CJ-2F超净工作台，苏州空气技术有限公司。
恒温培养箱，德国Binder公司。
离心机，日本HITACHI公司。
恒温金属浴，卡尤迪生物科技有限公司。
37°C恒温箱摇床，太仓华利达公司产品。
半干转膜仪，美国GE公司产品。
SCR-6型稳定稳压电泳仪，江苏丹阳无线电一厂。
1.1.4 实验用兔
6个月大小的新西兰公兔（母兔在饲养过程中发情会影响抗体的产生），购买的公兔需要一周左右的时间来适应，消除应激反应。
1.2 方法
1.2.1 获取PA蛋白
1.2.1.1 PA蛋白基因的获取与扩增
PA蛋白基因的获取：用限制性内切酶NdeI、BamHI对重组质粒pUC57-PA进行双酶切，37℃，30min，用1%琼脂糖核酸胶进行核酸电泳检测。然后用胶回收试剂盒对载体基因片段和优化过的PA蛋白基因片段（该片段优化由英骏生物技术有限公司完成）进行回收，-20℃保存备用，载体基因片段大小为4366bp，优化过的PA蛋白片段大小为363bp。
PA蛋白基因的扩增：将回收得到的载体片段片段与PA蛋白基因回收片段用T4连接酶进行连接，连接体系如下：10×T4 buffer：2.5μl ，载体片段：4μl，PA片段：10μl，T4连接酶：1μl，双蒸水：补齐至25μl；轻柔混匀，16℃，静置8-16h，得到的连接产物标记为pQZ-PA。
连接产物pQZ-PA转化DH5α感受态细胞：从-70℃取一支感受态细胞，置于冰水上溶解，在超净台内将10μl连接产物pQZ-PA转入感受态细胞，轻柔弹匀，冰水浴30min，然后再42℃水浴90s，快速转移至冰水浴上静置3-5min，加入1ml无抗液体LB培养基，混匀后放入37℃恒温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
摇床，100r/min，震荡30-60min，然后8000rpm，离心3min，超净台内弃去600μl上清，剩余培养基吹打混匀，取200μl涂布含有Amp+抗性的固体培养基，待液体阴干后37℃恒温培养箱倒置培养12-20h。
1.2.1.2 pQZ-PA表达载体的鉴定
从固体LB平板上挑取6个单克隆，转接入含有Amp+抗性的液体LB培养基，37℃恒温摇床，200r/min，震荡3培养12-20h，提取质粒进行鉴定。
提取质粒步骤（试剂盒提取）：1.向吸附柱中加入200μl Buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用；2.取培养好的菌液4-6ml，8000rpm离心1min，弃尽上清，加入250μl Solution I，用枪头充分悬浮细菌；3.加入250μl Solution II，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次（不宜超过5min），是菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液（如果未能变得清亮，可能是菌体过多，裂解不彻底，应减少菌液量），澄清后加入350μl Solution III，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min，12000rpm离心10min；4将上一个步骤获得的上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，室温6000rpm离心1min，取出DNA吸附柱，倒掉收集管中的废液；5.将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl W1 Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液后，重复用Wash Solution洗一次；6.倒掉收集管中的废液，12000rpm室温离心1min，彻底去除Wash Solution，打开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；7.将DNA吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在DNA吸附柱膜中央加入50-100μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12000rpm室温离心1min，EP管中的液体即为含目的质粒的溶液。
摘要：本试验旨在获得PA蛋白的多克隆抗体。首先将实验室已获得的PA蛋白序列进行优化；然后将优化基因片段克隆到原核表达载体pQZ上，构建重组质粒pQZ-PA，转化大肠杆菌BL21（DE3），进行蛋白表达；获得的PA蛋白经GEM颗粒一步纯化后免疫新西兰兔，四免后收集血清，用琼脂扩散的方法检测抗体效价，并用PA相关融合蛋白进行Western-blot鉴定。结果表明，PA蛋白在重组大肠杆菌中可溶性表达，免疫原性较好，血清琼扩效价可以达到1:4，Western-blot鉴定显示特异性良好。本研究成功获得的PA蛋白多克隆抗体，为PA蛋白的相关研究奠定基础。
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关键字:原核表达；PA蛋白；多克隆抗体
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法5
1.2.1获取PA蛋白5
1.2.2免疫家兔8
1.2.3 血清制备8
1.2.4琼脂扩散检测8
1.2.5Western Blot检测7
2结果9
2.1血清采集9
2.2 目的片段酶切结果 10
2.3 表达载体鉴定结果 10
2.4 表达及可溶性分析结果10
2.5 Western-Blot结果 11
2.6 琼脂扩散结果 12
3讨论12
致谢14
参考文献14
PA蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
引言
GEM表面展示系统是国外近年发展起来的一种抗原制备新技术。该技术包括GEM颗粒（Gram-positive bacterial enhancer matrix particles）和蛋白锚钩（Protein anchor, PA）两个构件。蛋白锚钩PA是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的一个结构域，可以非共价方式与GEM颗粒结合，与PA融合表达的目标蛋白可以展示在GEM颗粒表面，表明PA蛋白是GEM表面展示系统中的核心部件。[1]若能制备出锚钩蛋白PA的多克隆抗体，则可以在今后的研究中，进行与锚钩蛋白PA融合的目的蛋白的鉴定、目的蛋白与GEM结合效率评价等研究。[2]
大肠杆菌原核表达技术因其遗传背景清楚、操作简单方便、表达量高、成本低[3]而得到普遍应用，但是该系统表达的蛋白常因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
表达过快来不及正确折叠，或系统缺少促进蛋白正确折叠表达常以无活性的包涵体形式存在。[4]因此，实际工作中优化表达条件得到可溶性蛋白尤为重要。
本试验首先应用原核表达载体表达PA蛋白，然后经GEM颗粒一步纯化后免疫新西兰兔，多次免疫后收集血清，用琼脂扩散的方法检测抗体效价。本研究旨在成功获得的PA蛋白多克隆抗体，为PA蛋白的相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与载体
菌种：大肠杆菌BL-21（DE3）和DH5α、乳酸乳球菌MG1363
载体：原核表达载体pET-32a（+）
1.1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶：Nde I 、Hind III
购自大连TaKaRa公司的有：质粒提取试剂盒；Mini BEST 胶回收试剂盒；PCR 反应所需的Ex Taq酶、ＲTaq酶、dNTP、Ex Taq buffer、PCR buffer、镁离子；pMD18-T 载体;DNA连接酶；琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE凝胶电泳Marker 与buffer。
弗氏不完全佐剂：液体石蜡和羊毛脂的比例混合物。
弗氏完全佐剂：弗氏不完全佐剂加卡介苗或死的结核分枝杆菌。
其他试剂均为国产分析纯或实验室自制。
1.1.3 实验器材
SW-CJ-2F超净工作台，苏州空气技术有限公司。
恒温培养箱，德国Binder公司。
离心机，日本HITACHI公司。
恒温金属浴，卡尤迪生物科技有限公司。
37°C恒温箱摇床，太仓华利达公司产品。
半干转膜仪，美国GE公司产品。
SCR-6型稳定稳压电泳仪，江苏丹阳无线电一厂。
1.1.4 实验用兔
6个月大小的新西兰公兔（母兔在饲养过程中发情会影响抗体的产生），购买的公兔需要一周左右的时间来适应，消除应激反应。
1.2 方法
1.2.1 获取PA蛋白
1.2.1.1 PA蛋白基因的获取与扩增
PA蛋白基因的获取：用限制性内切酶NdeI、BamHI对重组质粒pUC57-PA进行双酶切，37℃，30min，用1%琼脂糖核酸胶进行核酸电泳检测。然后用胶回收试剂盒对载体基因片段和优化过的PA蛋白基因片段（该片段优化由英骏生物技术有限公司完成）进行回收，-20℃保存备用，载体基因片段大小为4366bp，优化过的PA蛋白片段大小为363bp。
PA蛋白基因的扩增：将回收得到的载体片段片段与PA蛋白基因回收片段用T4连接酶进行连接，连接体系如下：10×T4 buffer：2.5μl ，载体片段：4μl，PA片段：10μl，T4连接酶：1μl，双蒸水：补齐至25μl；轻柔混匀，16℃，静置8-16h，得到的连接产物标记为pQZ-PA。
连接产物pQZ-PA转化DH5α感受态细胞：从-70℃取一支感受态细胞，置于冰水上溶解，在超净台内将10μl连接产物pQZ-PA转入感受态细胞，轻柔弹匀，冰水浴30min，然后再42℃水浴90s，快速转移至冰水浴上静置3-5min，加入1ml无抗液体LB培养基，混匀后放入37℃恒温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
摇床，100r/min，震荡30-60min，然后8000rpm，离心3min，超净台内弃去600μl上清，剩余培养基吹打混匀，取200μl涂布含有Amp+抗性的固体培养基，待液体阴干后37℃恒温培养箱倒置培养12-20h。
1.2.1.2 pQZ-PA表达载体的鉴定
从固体LB平板上挑取6个单克隆，转接入含有Amp+抗性的液体LB培养基，37℃恒温摇床，200r/min，震荡3培养12-20h，提取质粒进行鉴定。
提取质粒步骤（试剂盒提取）：1.向吸附柱中加入200μl Buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用；2.取培养好的菌液4-6ml，8000rpm离心1min，弃尽上清，加入250μl Solution I，用枪头充分悬浮细菌；3.加入250μl Solution II，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次（不宜超过5min），是菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液（如果未能变得清亮，可能是菌体过多，裂解不彻底，应减少菌液量），澄清后加入350μl Solution III，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min，12000rpm离心10min；4将上一个步骤获得的上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，室温6000rpm离心1min，取出DNA吸附柱，倒掉收集管中的废液；5.将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl W1 Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液后，重复用Wash Solution洗一次；6.倒掉收集管中的废液，12000rpm室温离心1min，彻底去除Wash Solution，打开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；7.将DNA吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在DNA吸附柱膜中央加入50-100μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12000rpm室温离心1min，EP管中的液体即为含目的质粒的溶液。
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