铜污染土壤的植物菌根真菌联合修复
铜污染土壤的植物菌根真菌联合修复[20200614170808]
摘要：本文以耐铜经济作物孔雀草为材料，以中度Cu污染土壤（全Cu300—400mg/Kg）为土培基质，研究了赤子爱蚯蚓与内球囊霉丛植菌根菌的交互处理对孔雀草生长与土壤理化及酶活等指标的影响。结果表明，单一施加丛植菌根菌可以显著提高植物生物量，但同时也会降低土壤中有效P含量与过氧化氢酶及脲酶的活性，另一方面，单独添加赤子爱蚯蚓对土壤中的Cu元素有显著的活化作用，且对土壤中过氧化氢酶与脲酶的酶活有一定的提高，但对植物生物量的影响不显著。而在同时添加AMF与蚯蚓的条件下，植物的生物量与土壤的酶活都有显著提高，且土壤中有效P含量较对照相比没有明显差异。这一结果，论证了AMF与蚯蚓的添加能提高植物生物量和土壤中的重金属的生物有效性及相关酶活性,肯定了在重金属污染土壤中植物-AMF-蚯蚓的联合修复技术的可行性。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:AMF；地上部分；元素分析；酶活性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 前期处理2
1.2.2后期实验2
2 结果与分析4
2.1 AMF侵染验证实验4
2.2植物生物量5
2.3地上部元素含量6
2.4土壤元素分析6
2.4.1 土壤有效磷含量6
2.4.2土壤总铜含量7
2.5 土壤酶活性7
3讨论 8
致谢8
参考文献9
铜污染土壤的植物-菌根真菌联合修复
生命基地班学生 王岩岩
引言
引言
近年来的重金属污染治理大都属于化学或物理修复技术。但这些方法成本高,效率不理想，破坏土壤结构以及微生物区系, 引起土壤中营养成分的损失[7]。自1983年，Chaney等首次提出利用植物去除污染土壤中重金属的设想，人们逐渐将研究重点转向了植物修复技术。植物修复是利用植物及与其共存的微生物等对土壤中的污染物进行固定、吸收，以清除污染物或使其有害性得以降低或消失。重金属污染土壤的植物修复主要包含植物提取和植物稳定，也是目前最接近商业化的修复技术[2]。植物稳定修复在矿区大量使用如废弃矿山的复垦工程，各种尾矿库的植被重建等。虽然植物稳定并没有将重金属从土壤中彻底去除，然而利用重金属耐性或排斥型经济植物（如能源植物等）对重金属污染废弃地进行植物稳定钝化修复，在达到生态修复的同时，可实现生态和经济效益的双赢[8]，是目前最合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
理的矿山废弃地修复技术。
然而植物修复技术的成功施用受制于两个因素：超积累植物[9]的生长速度缓慢和生物量小；土壤中重金属的生物有效性低。研究表明，蚯蚓活动显著增加了红壤DTPA 提取态锌和黄泥土中的有机结合态锌[11]，故蚯蚓通过其生命活动, 改良土壤性质, 提高土壤中重金属的生物有效性。在逆境条件下, 丛枝菌根能通过扩大根系吸收范围、活化土壤养分[15]、增强植物抗性等多种机制, 显著地促进寄主植物的生长[12]。1981年, Bradley等首次报道石楠属菌根能降低宿主植物对过量重金属锌和铜的吸收以来[14], 菌根真菌对重金属污染土壤中菌根植物系统与重金属元素的相互作用, 以及菌根植物对重金属污染的生物修复可行性等研究已逐渐引起人们的关注。故为解决上述限制条件，我们引入了植物，蚯蚓，微生物联合修复研究体系。
1. 材料与方法
1.1材料
植物：耐铜经济作物孔雀草（Tagetes patula L.）
蚯蚓：赤子爱蚯蚓(Eisenia foetida)
丛生菌根真菌：根内球囊霉（ G.intraradices.）
1.2 方法
1.2.1前期处理
将采得的植物样品带回实验室，先用自来水洗净，再用去离子水清洗一遍，用吸水纸吸干表面水分，将根皮剥下，-20℃保存备用。用于测定土壤理化性质和重金属的土壤样品带回实验室后自然风干，用玛瑙研钵研磨，分别过20、60、100目筛。
实验容器为长25cm，直径10cm的PVC管，底部包裹纱网避免蚯蚓从底部逸出，上部同样架出5cm纱网，避免蚯蚓从上部逃出。土壤选择汤山中低程度铜污染土壤。处理如下表所示，其中，植物代表种植孔雀草3株，蚯蚓代表投放蚯蚓5只，AMF代表加入丛枝菌根真菌5克。
处理方式 编号 植物 AMF 蚯蚓
Control - - -
P + - -
P+A + + -
P+E + - +
P+A+E + + +
注：P代表植物；A代表AMF；E代表蚯蚓
1.2.2 后期实验
实验持续十二周后收样，将植物杀青烘干后利用消煮-ICP法测量重金属含量[5]，土壤风干收样后按照《国家土壤肥力与肥料效益长期监测研究技术规程》中的方法测定土壤各理化性质。pH值采用水浸法及电位[3] 。
[1]AMF菌根侵染检测采用墨水醋染色法
侵染测定步骤包括：固定、透明、染色、制片、观察。
固定：选择细的、坚韧的根，洗净，用吸水纸吸干水分，剪成1cm长根段，置于塑料瓶中，加入FAA固定液浸没根段，固定4h以上。
透明：将大约2g根段从FAA固定液取出，用水冲洗，淋干，放入50ml烧杯中，加入10%KOH浸没根段，浸泡时间和加热程度随根的粗度和硬度、老根和幼根而不同。在水浴锅中90℃加热1h，在BGC用电热板加热煮沸10min，透明生长30d的根段，加热结束倒去KOH，清水轻轻漂洗根样数次（颜色较深的根需要在清洗后进行脱色处理，在根中加入双氧水），切勿用力搅动，控干水分，放入50ml烧杯中。
染色：向上述装有透明洗净根的烧杯中加入墨水醋（95ml家用白醋，5ml墨水）染色剂，煮 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
开3min染色（适用于在BGC生长30d的根段）,倒出多余的染色剂，用自来水冲洗，染过色的根段放在水中保存。
制片：用镊子将染色根段取出并整齐地排列在干净的载玻片上，一根载玻片上放15个根段，每个样品两张载玻片，共30条根段。然后在载玻片上加2-3滴乳酸，放上盖玻片，轻轻挤压，把根段压扁，以便观察根的皮层细胞，在同一张载玻片上要放置粗细一样的根段，同时除去其中的气泡，抹去边缘多余的乳酸，即可在光学显微镜下观察菌根结构。
观察：光学显微镜下可以清晰看到菌根的组织结构，如菌丝，泡囊等。
[2] 有机质采用丘林法（180℃油浴）
土壤有机质的测定参照《土壤农化分析》采用重铬酸钾容量法。具体方法如下：
在分析天平上准确称取过60目筛子的土壤样品0.10 g，用称量纸把称取的样品全部倒入消煮管中，准确加入0.136mol/L K2Cr2O7-H2SO4溶液10 mL，加入约3 mL时摇动试管，以使土壤分散。将消煮管放入消解炉中，温度控制在170～180℃，待管中液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5 min，取出消煮管。冷却后，将管中内容物小心仔细地全部洗入250 mL的三角瓶中，使瓶内总体积在60～70 mL,保持其中硫酸浓度为1～1.5 molL-1,此时溶液的颜色应为橙黄色或淡黄色。然后加邻啡罗啉指示剂3～4滴，用0.2 molL-1的标准FeSO4溶液滴定，溶液由黄色经过绿色、淡绿色突变为棕红色即为终点。在测定样品的同时必须做两个空白试验，取其平均值。
[3]土壤有效磷以及重金属元素分别采用碳酸氢钠法及硝酸高氯酸消煮-ICP检测法[6]
土壤有效磷的测定: 称取过20目筛的风干土样2 g（精确到0.01g）于50 mL三角瓶中，准确加入0.5 molL-1碳酸氢钠溶液40 mL,再加一小角勺无磷活性碳，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡30 min（振荡机速率为每分钟150～180次），立即用无磷滤纸干过滤，滤液承接于50 mL三角瓶中。最初3～5 mL滤液弃去。吸取滤液4 mL于试管中，加硫酸钼锑抗混合显色剂2 mL充分摇匀，排出二氧化碳后加水定容至25 mL，再充分摇匀。30 min后，在分光光度计上比色（波长660 nm），比色时须同时做空白测定。
摘要：本文以耐铜经济作物孔雀草为材料，以中度Cu污染土壤（全Cu300—400mg/Kg）为土培基质，研究了赤子爱蚯蚓与内球囊霉丛植菌根菌的交互处理对孔雀草生长与土壤理化及酶活等指标的影响。结果表明，单一施加丛植菌根菌可以显著提高植物生物量，但同时也会降低土壤中有效P含量与过氧化氢酶及脲酶的活性，另一方面，单独添加赤子爱蚯蚓对土壤中的Cu元素有显著的活化作用，且对土壤中过氧化氢酶与脲酶的酶活有一定的提高，但对植物生物量的影响不显著。而在同时添加AMF与蚯蚓的条件下，植物的生物量与土壤的酶活都有显著提高，且土壤中有效P含量较对照相比没有明显差异。这一结果，论证了AMF与蚯蚓的添加能提高植物生物量和土壤中的重金属的生物有效性及相关酶活性,肯定了在重金属污染土壤中植物-AMF-蚯蚓的联合修复技术的可行性。
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关键字:AMF；地上部分；元素分析；酶活性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 前期处理2
1.2.2后期实验2
2 结果与分析4
2.1 AMF侵染验证实验4
2.2植物生物量5
2.3地上部元素含量6
2.4土壤元素分析6
2.4.1 土壤有效磷含量6
2.4.2土壤总铜含量7
2.5 土壤酶活性7
3讨论 8
致谢8
参考文献9
铜污染土壤的植物-菌根真菌联合修复
生命基地班学生 王岩岩
引言
引言
近年来的重金属污染治理大都属于化学或物理修复技术。但这些方法成本高,效率不理想，破坏土壤结构以及微生物区系, 引起土壤中营养成分的损失[7]。自1983年，Chaney等首次提出利用植物去除污染土壤中重金属的设想，人们逐渐将研究重点转向了植物修复技术。植物修复是利用植物及与其共存的微生物等对土壤中的污染物进行固定、吸收，以清除污染物或使其有害性得以降低或消失。重金属污染土壤的植物修复主要包含植物提取和植物稳定，也是目前最接近商业化的修复技术[2]。植物稳定修复在矿区大量使用如废弃矿山的复垦工程，各种尾矿库的植被重建等。虽然植物稳定并没有将重金属从土壤中彻底去除，然而利用重金属耐性或排斥型经济植物（如能源植物等）对重金属污染废弃地进行植物稳定钝化修复，在达到生态修复的同时，可实现生态和经济效益的双赢[8]，是目前最合 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
理的矿山废弃地修复技术。
然而植物修复技术的成功施用受制于两个因素：超积累植物[9]的生长速度缓慢和生物量小；土壤中重金属的生物有效性低。研究表明，蚯蚓活动显著增加了红壤DTPA 提取态锌和黄泥土中的有机结合态锌[11]，故蚯蚓通过其生命活动, 改良土壤性质, 提高土壤中重金属的生物有效性。在逆境条件下, 丛枝菌根能通过扩大根系吸收范围、活化土壤养分[15]、增强植物抗性等多种机制, 显著地促进寄主植物的生长[12]。1981年, Bradley等首次报道石楠属菌根能降低宿主植物对过量重金属锌和铜的吸收以来[14], 菌根真菌对重金属污染土壤中菌根植物系统与重金属元素的相互作用, 以及菌根植物对重金属污染的生物修复可行性等研究已逐渐引起人们的关注。故为解决上述限制条件，我们引入了植物，蚯蚓，微生物联合修复研究体系。
1. 材料与方法
1.1材料
植物：耐铜经济作物孔雀草（Tagetes patula L.）
蚯蚓：赤子爱蚯蚓(Eisenia foetida)
丛生菌根真菌：根内球囊霉（ G.intraradices.）
1.2 方法
1.2.1前期处理
将采得的植物样品带回实验室，先用自来水洗净，再用去离子水清洗一遍，用吸水纸吸干表面水分，将根皮剥下，-20℃保存备用。用于测定土壤理化性质和重金属的土壤样品带回实验室后自然风干，用玛瑙研钵研磨，分别过20、60、100目筛。
实验容器为长25cm，直径10cm的PVC管，底部包裹纱网避免蚯蚓从底部逸出，上部同样架出5cm纱网，避免蚯蚓从上部逃出。土壤选择汤山中低程度铜污染土壤。处理如下表所示，其中，植物代表种植孔雀草3株，蚯蚓代表投放蚯蚓5只，AMF代表加入丛枝菌根真菌5克。
处理方式 编号 植物 AMF 蚯蚓
Control - - -
P + - -
P+A + + -
P+E + - +
P+A+E + + +
注：P代表植物；A代表AMF；E代表蚯蚓
1.2.2 后期实验
实验持续十二周后收样，将植物杀青烘干后利用消煮-ICP法测量重金属含量[5]，土壤风干收样后按照《国家土壤肥力与肥料效益长期监测研究技术规程》中的方法测定土壤各理化性质。pH值采用水浸法及电位[3] 。
[1]AMF菌根侵染检测采用墨水醋染色法
侵染测定步骤包括：固定、透明、染色、制片、观察。
固定：选择细的、坚韧的根，洗净，用吸水纸吸干水分，剪成1cm长根段，置于塑料瓶中，加入FAA固定液浸没根段，固定4h以上。
透明：将大约2g根段从FAA固定液取出，用水冲洗，淋干，放入50ml烧杯中，加入10%KOH浸没根段，浸泡时间和加热程度随根的粗度和硬度、老根和幼根而不同。在水浴锅中90℃加热1h，在BGC用电热板加热煮沸10min，透明生长30d的根段，加热结束倒去KOH，清水轻轻漂洗根样数次（颜色较深的根需要在清洗后进行脱色处理，在根中加入双氧水），切勿用力搅动，控干水分，放入50ml烧杯中。
染色：向上述装有透明洗净根的烧杯中加入墨水醋（95ml家用白醋，5ml墨水）染色剂，煮 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
开3min染色（适用于在BGC生长30d的根段）,倒出多余的染色剂，用自来水冲洗，染过色的根段放在水中保存。
制片：用镊子将染色根段取出并整齐地排列在干净的载玻片上，一根载玻片上放15个根段，每个样品两张载玻片，共30条根段。然后在载玻片上加2-3滴乳酸，放上盖玻片，轻轻挤压，把根段压扁，以便观察根的皮层细胞，在同一张载玻片上要放置粗细一样的根段，同时除去其中的气泡，抹去边缘多余的乳酸，即可在光学显微镜下观察菌根结构。
观察：光学显微镜下可以清晰看到菌根的组织结构，如菌丝，泡囊等。
[2] 有机质采用丘林法（180℃油浴）
土壤有机质的测定参照《土壤农化分析》采用重铬酸钾容量法。具体方法如下：
在分析天平上准确称取过60目筛子的土壤样品0.10 g，用称量纸把称取的样品全部倒入消煮管中，准确加入0.136mol/L K2Cr2O7-H2SO4溶液10 mL，加入约3 mL时摇动试管，以使土壤分散。将消煮管放入消解炉中，温度控制在170～180℃，待管中液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5 min，取出消煮管。冷却后，将管中内容物小心仔细地全部洗入250 mL的三角瓶中，使瓶内总体积在60～70 mL,保持其中硫酸浓度为1～1.5 molL-1,此时溶液的颜色应为橙黄色或淡黄色。然后加邻啡罗啉指示剂3～4滴，用0.2 molL-1的标准FeSO4溶液滴定，溶液由黄色经过绿色、淡绿色突变为棕红色即为终点。在测定样品的同时必须做两个空白试验，取其平均值。
[3]土壤有效磷以及重金属元素分别采用碳酸氢钠法及硝酸高氯酸消煮-ICP检测法[6]
土壤有效磷的测定: 称取过20目筛的风干土样2 g（精确到0.01g）于50 mL三角瓶中，准确加入0.5 molL-1碳酸氢钠溶液40 mL,再加一小角勺无磷活性碳，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡30 min（振荡机速率为每分钟150～180次），立即用无磷滤纸干过滤，滤液承接于50 mL三角瓶中。最初3～5 mL滤液弃去。吸取滤液4 mL于试管中，加硫酸钼锑抗混合显色剂2 mL充分摇匀，排出二氧化碳后加水定容至25 mL，再充分摇匀。30 min后，在分光光度计上比色（波长660 nm），比色时须同时做空白测定。
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