灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究
灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究[20200614171413]
摘要：灵芝的次生代谢产物是灵芝的主要药用成分，具有广泛的药理活性。血红素加氧酶是催化血红素降解的起始和限速酶，其中HO-1能被较多氧化应激源激活。本文通过克隆灵芝血红素单加氧酶HO-1全长及其cDNA，并构建HO基因沉默突变体，探索HO基因在灵芝生长过程与次生代谢中的作用及其生理机制。目前发现与野生型灵芝G20相比，HO沉默突变体对H2O2胁迫更加敏感，而外源添加HO诱导剂hemin可部分恢复其菌丝生长，且由于HO沉默转化子中NO及ROS含量增长，可推测HO可能通过NO信号通路对氧胁迫有缓释作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:血红素单加氧酶；RNA干扰；氧胁迫
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 2
1.1. 材料 2
1.2. 方法 2
1.2.1. 菌种培养和收集 2
1.2.2. 灵芝基因组DNA的提取 2
1.2.3. 灵芝cDNA制备 2
1.2.4. HO基因组全长的克隆 2
1.2.5. HO沉默载体的构建与筛选 3
1.2.6. 比色法测定HO沉默突变体中三萜含量 4
1.2.7. 荧光探针法标示HO突变体中NO及ROS含量及荧光增白剂染色 4
2. 结果与分析 4
2.1. 基因组全长克隆 4
2.2. 沉默转化子的构建与筛选 5
2.3. 沉默突变体的三萜含量 6
2.4. HO基因沉默对灵芝菌丝生长及其形态的影响 6
2.5. HO基因沉默对灵芝内NO及ROS的影响 7
2.6. HO基因沉默对灵芝菌丝氧胁迫敏感性的影响 8
3. 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究
引言
引言
灵芝(Ganoderma lucidum）隶属非褶菌目(Aphyllophorales)灵芝科(Ganodermata-ceae)灵芝属真菌，在我国有悠久的药用历史。灵芝中的生物碱、多肽、多糖、三萜、微量元素等成分是其有效的药用成分，而三萜则是主要活性成分之一，目前已发现大约有二百种[1]。药理学研究表明三萜类灵芝酸在保护肝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
功能、抗肿瘤、抗氧化、抗HIV蛋白酶活性方面有重要作用[2、3]。
血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是催化血红素（heme）降解的起始酶和限速酶，其代谢产物为一氧化碳（carbon monoxide, CO）、胆绿素（biliberdin BV）和Fe2+ [4]，该过程由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）提供电子[5]。目前发现有三种不同类型的HO，其中HO-1属于诱导型血红素加氧酶，能被较多的氧化应激源激活。已知hemin是HO诱导剂。
现有医学及动物学研究表明，冠心病患者的血浆脂联素与HO-1密切相关，可能存在相互调节的作用[6]。HO-1表达量的增加可降低高糖与高脂对动物内皮细胞的损伤。HO-1在ApoE缺陷小鼠中表达，发挥抗炎、抗凋亡作用，同时HO-1也诱导CO的释放，具有拮抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）炎症反应，防治AS的作用[8]。在植物中，血红素加氧酶/一氧化碳信号系统在黄瓜不定根发生过程中可起到一定的诱导调控作用[9-10]，同时，该系统也参与调控渗透胁迫下小麦种子的萌发以及幼苗的脱黄化[11]。在菌类研究中，尚无有关HO基因功能的研究。
一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体中一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子，以动物为材料的研究表明，NO对生物体的作用具有双重性一方面，低浓度NO能迅速清除超氧阴离子和脂质自由基，阻断包括脂质过氧化在内的ROS参与的各种伤害效应，而且能诱导抗氧化酶基因的表达，从而具有保护作用；另一方面，高浓度NO与O相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子，后者质子化再形成具有强氧化性的过氧亚硝酸，破坏生物大分子的结构与功能，最终具有生物毒性[12]。在菌物中有研究表明，在杏鲍菇内，NO可以有效的保护其菌丝抵御热胁迫下的氧损伤，即降低其菌丝内ROS含量[13]。
本课题主要研究血红素单加氧酶HO-1对灵芝菌丝体生长及灵芝次生代谢产物合成的影响，通过构建HO沉默载体、筛选HO沉默转化子，探讨HO-1对灵芝生长及次生代谢的影响，并初步推测其作用路径。这将有助于进一步研究HO基因在灵芝体内的生理功能及作用路径。也将有助于通过调控灵芝生物合成相关的基因，提高灵芝次生代谢产物含量，进一步提高灵芝的药用价值及灵芝的药用商品性。
1. 材料与方法
1.1. 材料
灵芝（G. lucidum）、大肠杆菌DH5α由本实验室保存；质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司，其他载体由本实验室保存。
1.2. 方法
1.2.1. 菌种培养和收集
1) 液体发酵培养：灵芝菌株在PDA或CYM培养基中，150 rpm，28°C培养7d，收集菌丝，-70°C储存备用。
2) 平板培养：使用打孔器或接种针挑取灵芝菌丝及部分培养基于新倒平板上，28°C恒温培养箱培养。
1.2.2. 灵芝基因组DNA的提取（CTAB法）[14、15]
灵芝基因组DNA的提取方法参照2012年任昂[14]2013年穆大帅博士学位论文[15]。
1.2.3. 灵芝cDNA制备[14]
灵芝cDNA制备方法 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
参考2012年任昂[14]博士学位论文。
1.2.4. HO基因组全长的克隆
根据实验室前期获得的HO基因序列设计全长引物G.l-HO-BamH1-F和G.l-HO-Xba1-R，沉默引物G.l-HOi-Spe1-F和G.l-HOi-Kpn1-R，序列如下：
全长引物：
G.l-HO-BamH1-F：5′ -GTACGGATCC ATGTCCACCAGCAAGA -3′
G.l-HO-Xba1-R：5′ -GTACTCTAGA TTATGCGTGGGCAGGA -3′
沉默引物：
G.l-HOi-Spe1-F：5′ -ATCGACTAGT ACATCACGCTGACGACG -3′
G.l-HOi-Kpn1-R：5′ -ATCGGGTACC AGAGGGGAGTAGACGGA -3′
以灵芝基因组DNA为及cDNA为模板，进行HO基因全长和其沉默片段的PCR扩增。
1) PCR反应体系为：
10×pfu Buffer 2.5 μL
dNTPs (each 10 mM) 2 μL
上游引物(20 mM) 1 μL
下游引物(20 mM) 1 μL
DNA模板 1 μL
ddH2O 17.1 μL
Pfu 酶 (5 U/μL) 0.2 μL
总体积 25 μL
ddH2O 7.2μL
[10] 宣伟. 血红素加氧酶/一氧化碳信号系统参与生长素调控的黄瓜不定根发生[D]. 大学, 2009.
摘要：灵芝的次生代谢产物是灵芝的主要药用成分，具有广泛的药理活性。血红素加氧酶是催化血红素降解的起始和限速酶，其中HO-1能被较多氧化应激源激活。本文通过克隆灵芝血红素单加氧酶HO-1全长及其cDNA，并构建HO基因沉默突变体，探索HO基因在灵芝生长过程与次生代谢中的作用及其生理机制。目前发现与野生型灵芝G20相比，HO沉默突变体对H2O2胁迫更加敏感，而外源添加HO诱导剂hemin可部分恢复其菌丝生长，且由于HO沉默转化子中NO及ROS含量增长，可推测HO可能通过NO信号通路对氧胁迫有缓释作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:血红素单加氧酶；RNA干扰；氧胁迫
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 2
1.1. 材料 2
1.2. 方法 2
1.2.1. 菌种培养和收集 2
1.2.2. 灵芝基因组DNA的提取 2
1.2.3. 灵芝cDNA制备 2
1.2.4. HO基因组全长的克隆 2
1.2.5. HO沉默载体的构建与筛选 3
1.2.6. 比色法测定HO沉默突变体中三萜含量 4
1.2.7. 荧光探针法标示HO突变体中NO及ROS含量及荧光增白剂染色 4
2. 结果与分析 4
2.1. 基因组全长克隆 4
2.2. 沉默转化子的构建与筛选 5
2.3. 沉默突变体的三萜含量 6
2.4. HO基因沉默对灵芝菌丝生长及其形态的影响 6
2.5. HO基因沉默对灵芝内NO及ROS的影响 7
2.6. HO基因沉默对灵芝菌丝氧胁迫敏感性的影响 8
3. 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
灵芝血红素单加氧酶基因全长的克隆及基因功能研究
引言
引言
灵芝(Ganoderma lucidum）隶属非褶菌目(Aphyllophorales)灵芝科(Ganodermata-ceae)灵芝属真菌，在我国有悠久的药用历史。灵芝中的生物碱、多肽、多糖、三萜、微量元素等成分是其有效的药用成分，而三萜则是主要活性成分之一，目前已发现大约有二百种[1]。药理学研究表明三萜类灵芝酸在保护肝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
功能、抗肿瘤、抗氧化、抗HIV蛋白酶活性方面有重要作用[2、3]。
血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是催化血红素（heme）降解的起始酶和限速酶，其代谢产物为一氧化碳（carbon monoxide, CO）、胆绿素（biliberdin BV）和Fe2+ [4]，该过程由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）提供电子[5]。目前发现有三种不同类型的HO，其中HO-1属于诱导型血红素加氧酶，能被较多的氧化应激源激活。已知hemin是HO诱导剂。
现有医学及动物学研究表明，冠心病患者的血浆脂联素与HO-1密切相关，可能存在相互调节的作用[6]。HO-1表达量的增加可降低高糖与高脂对动物内皮细胞的损伤。HO-1在ApoE缺陷小鼠中表达，发挥抗炎、抗凋亡作用，同时HO-1也诱导CO的释放，具有拮抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）炎症反应，防治AS的作用[8]。在植物中，血红素加氧酶/一氧化碳信号系统在黄瓜不定根发生过程中可起到一定的诱导调控作用[9-10]，同时，该系统也参与调控渗透胁迫下小麦种子的萌发以及幼苗的脱黄化[11]。在菌类研究中，尚无有关HO基因功能的研究。
一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体中一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子，以动物为材料的研究表明，NO对生物体的作用具有双重性一方面，低浓度NO能迅速清除超氧阴离子和脂质自由基，阻断包括脂质过氧化在内的ROS参与的各种伤害效应，而且能诱导抗氧化酶基因的表达，从而具有保护作用；另一方面，高浓度NO与O相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子，后者质子化再形成具有强氧化性的过氧亚硝酸，破坏生物大分子的结构与功能，最终具有生物毒性[12]。在菌物中有研究表明，在杏鲍菇内，NO可以有效的保护其菌丝抵御热胁迫下的氧损伤，即降低其菌丝内ROS含量[13]。
本课题主要研究血红素单加氧酶HO-1对灵芝菌丝体生长及灵芝次生代谢产物合成的影响，通过构建HO沉默载体、筛选HO沉默转化子，探讨HO-1对灵芝生长及次生代谢的影响，并初步推测其作用路径。这将有助于进一步研究HO基因在灵芝体内的生理功能及作用路径。也将有助于通过调控灵芝生物合成相关的基因，提高灵芝次生代谢产物含量，进一步提高灵芝的药用价值及灵芝的药用商品性。
1. 材料与方法
1.1. 材料
灵芝（G. lucidum）、大肠杆菌DH5α由本实验室保存；质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司，其他载体由本实验室保存。
1.2. 方法
1.2.1. 菌种培养和收集
1) 液体发酵培养：灵芝菌株在PDA或CYM培养基中，150 rpm，28°C培养7d，收集菌丝，-70°C储存备用。
2) 平板培养：使用打孔器或接种针挑取灵芝菌丝及部分培养基于新倒平板上，28°C恒温培养箱培养。
1.2.2. 灵芝基因组DNA的提取（CTAB法）[14、15]
灵芝基因组DNA的提取方法参照2012年任昂[14]2013年穆大帅博士学位论文[15]。
1.2.3. 灵芝cDNA制备[14]
灵芝cDNA制备方法 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
参考2012年任昂[14]博士学位论文。
1.2.4. HO基因组全长的克隆
根据实验室前期获得的HO基因序列设计全长引物G.l-HO-BamH1-F和G.l-HO-Xba1-R，沉默引物G.l-HOi-Spe1-F和G.l-HOi-Kpn1-R，序列如下：
全长引物：
G.l-HO-BamH1-F：5′ -GTACGGATCC ATGTCCACCAGCAAGA -3′
G.l-HO-Xba1-R：5′ -GTACTCTAGA TTATGCGTGGGCAGGA -3′
沉默引物：
G.l-HOi-Spe1-F：5′ -ATCGACTAGT ACATCACGCTGACGACG -3′
G.l-HOi-Kpn1-R：5′ -ATCGGGTACC AGAGGGGAGTAGACGGA -3′
以灵芝基因组DNA为及cDNA为模板，进行HO基因全长和其沉默片段的PCR扩增。
1) PCR反应体系为：
10×pfu Buffer 2.5 μL
dNTPs (each 10 mM) 2 μL
上游引物(20 mM) 1 μL
下游引物(20 mM) 1 μL
DNA模板 1 μL
ddH2O 17.1 μL
Pfu 酶 (5 U/μL) 0.2 μL
总体积 25 μL
ddH2O 7.2μL
[10] 宣伟. 血红素加氧酶/一氧化碳信号系统参与生长素调控的黄瓜不定根发生[D]. 大学, 2009.
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