转录因子MA-1在M1M2型巨噬细胞极化中的作用
转录因子MA-1在M1M2型巨噬细胞极化中的作用[20200614172625]
摘要：巨噬细胞根据其发挥功能，被分为二类：经典激活的巨噬细胞和选择激活的巨噬细胞，分别发挥抗感染及组织修复功能。本研究证实了MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用。MA-1在M1型巨噬细胞中低表达，M2型巨噬细胞中相对高表达。在M1型巨噬细胞中过表达MA-1可抑制M1特异性细胞因子的表达。相反，M2型巨噬细胞中干扰MA-1和MA-1敲除小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中显示M2型特异性标志分子表达受损。
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关键字:MA-1；M1；M2；巨噬细胞极化
目录
摘要 - 1 -
关键词 - 1 -
Abstract - 1 -
Key words - 1 -
引言 - 1 -
1 材料与方法 - 2 -
1.1 材料 - 2 -
1.1.1 实验动物 - 2 -
1.1.2 载体、菌株和分子克隆相关试剂 - 3 -
1.1.3 主要试剂和抗体 - 3 -
1.1.4 主要设备和软件 - 3 -
1.1.5 引物 - 4 -
1.2 方法 - 4 -
1.2.1 M1及M2型骨髓来源巨噬细胞的诱导 - 4 -
1.2.2 人外周血单核细胞来源M1/M2型巨噬细胞诱导 - 5 -
1.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞的分离 - 5 -
1.2.4 细胞总RNA抽提，cDNA制备及定量PCR - 5 -
1.2.5 MA-1过表达载体的构建 - 6 -
1.2.6 质粒在M1型巨噬细胞中的转染 - 6 -
1.2.7 M2型巨噬细胞中MA-1 siRNA转染 - 7 -
1.2.8 Western Blot检测MA-1表达量 - 7 -
1.2.9 统计学处理 - 7 -
2 结果与分析 - 7 -
2.1 过表达质粒pCMV Tag2b-MA-1的构建 - 7 -
2.1.1 MA-1全长基因T载体的构建 - 7 -
2.1.2 过表达质粒pCMV Tag2b-MA-1的构建 - 8 -
2.2 转录因子MA-1在M2型巨 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
噬细胞中相对高表达 - 8 -
2.3 MA-1在M1中过表达，M1型巨噬细胞相关基因表达下降 - 9 -
2.4 MA-1在M2中敲除，M2型巨噬细胞相关基因表达下降 - 10 -
3 讨论 - 11 -
致谢 - 11 -
参考文献： - 12 -
附录 - 13 -
转录因子MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用
引言
巨噬细胞是一类免疫细胞，对于病原体感染或组织损害引起的炎症十分重要[1]。研究证实巨噬细胞具有相当大的可塑性，使其对环境信号产生有效应答，改变其表型及生理功能从而对细胞因子及微生物刺激做出应答[2]。这些改变产生了具有不同功能的巨噬细胞亚型，其表型分别以产生前炎性和抗炎细胞因子为特征[3]。在T helper-1 (Th-1)， T helper-2 (Th-2)分化这一概念的基础上[4]，巨噬细胞被分为经典激活的巨噬细胞（Classical Activated Marcophage，M1）（产生前炎性细胞因子，抵抗病原体，参与组织损害）和选择激活的巨噬细胞（Alternated Activated Macrophage，M2）（产生抗炎细胞因子，促进组织修复与重塑）[3, 5]。
一系列起决定作用的转录因子的活化是T细胞亚群的特征：如T-bet与Th-1有关，GATA-3与Th-2有关，Foxp3与Treg有关，RORγt与Th17有关[6]。树突状细胞（Dendritic Cell，DC）发挥作用需要转录因子IRF4和IRF8参与。CD4+ DC高表达IRF4，而浆细胞样DC低表达IRF4。因此，irf4-/-小鼠缺乏CD4+ DC。相反，浆细胞样DC和CD8+ DC高表达IRF8，因此，irf8-/-小鼠缺乏这些DC亚群[7]。近年来，许多研究小组致力于寻找调控巨噬细胞极化的转录因子，并取得了一定进展。研究证实转录因子NF-kB亚基p50激活抑制M1型巨噬细胞极化相关基因[8]，而转录因子C/EBPβ上调M2型巨噬细胞特异性基因[9]，IRF4通过刺激M2型巨噬细胞特异性标志分子的表达调控M2型巨噬细胞的极化[10]。
MA-1（Macrophage associated factor 1）是一种锌指转录因子，具有4个Kru¨ppel样锌指结构，且结构在哺乳动物进化中高度保守[11]。MA-1最初在人类细胞中被克隆，并被认为是一个转录抑制因子，可以结合到GC富集的启动子上。目前的研究也提示该基因可能作为转录抑制因子调控下游靶基因[12, 13]。已经显示MA-1广泛性低表达，但在胎盘及成人肾脏、肝脏和淋巴细胞中相对高表达[12]。一些研究已经提示MA-1在调控干细胞多潜能性和发育过程中发挥着功能。首先，一项较早的研究利用转录组分析检测了人胚胎干细胞（Embryo Stem Cells，ESCs）及其分化细胞，该研究认为MA-1在未分化的人ESCs中相对高表达，随着ESCs分化表达降低[14]。MA-1通过直接调节特定靶基因来控制胚胎干细胞的多能性，它是Nanog的一个重要互作分子[15]，也是Oct4和Sox2的互作分子[16]。其次，一项在结肠直肠癌细胞及人胚肾细胞中关于c-Myc相关蛋白的研究认为，MA-1是c-Myc的一个互作成员[17]。c-Myc是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
编码对于干细胞维持[18]及诱导多潜能性[19]的转录因子的致癌基因。再次，MA-1已经被认为是皮肤microRNA-203的候选靶基因，microRNA-203促进上皮分化，抑制干性[20]。这些提示MA-1可能在成年干细胞维持及皮肤发育中发挥中重要作用。第四，SOX4是一个重要的发育转录因子，在多种组织中控制分化及增殖，并在很多癌症类型中异常表达[21]。用ChIP及ChIP-chip分析人前列腺癌细胞SOX4转录网络，结果显示MA-1是SOX4的直接转录靶点。综上所述，MA-1很可能在细胞增殖、分化、肿瘤形成、干细胞维持、胚胎形成及发育中发挥着多种功能。但是，有关MA-1组织表达谱研究显示MA-1除了在未分化的ESCs中高表达，在小鼠及人一些成体组织中也较高表达，如肾脏、肝脏和淋巴细胞等[12]。这提示MA-1可能在一些成体组织或器官中发挥作用。
本研究证明了MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用。MA-1在M1型巨噬细胞中低表达，M2型巨噬细胞中相对高表达。在M1型巨噬细胞中过表达MA-1可抑制M1特异性细胞因子的表达。相反，M2型巨噬细胞中干扰MA-1和MA-1敲除小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中显示M2型特异性标志分子表达受损。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自上海斯莱克动物有限公司，饲养于浙江大学实验动物中心SPF级环境。
1.1.2 载体、菌株和分子克隆相关试剂
pCMV tag2b（图1）购自Agilent公司。大肠杆菌DH5α由本实验室常规保存。琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司。DNA回收试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Axygen。无内毒素质粒抽提试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司。Endo-free Plamid midi Kit购自QIAGEN公司。细胞总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen。Taq聚合酶，pMD 18-T Simple Vector，逆转录试剂盒，实时荧光定量PCR检测试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自Takara。高保真PCR聚合酶KOD-Plus-Neo来自Toyobo。T4 DNA连接酶，限制性内切酶EcoRV， HindIII购自NEB。
摘要：巨噬细胞根据其发挥功能，被分为二类：经典激活的巨噬细胞和选择激活的巨噬细胞，分别发挥抗感染及组织修复功能。本研究证实了MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用。MA-1在M1型巨噬细胞中低表达，M2型巨噬细胞中相对高表达。在M1型巨噬细胞中过表达MA-1可抑制M1特异性细胞因子的表达。相反，M2型巨噬细胞中干扰MA-1和MA-1敲除小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中显示M2型特异性标志分子表达受损。
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关键字:MA-1；M1；M2；巨噬细胞极化
目录
摘要 - 1 -
关键词 - 1 -
Abstract - 1 -
Key words - 1 -
引言 - 1 -
1 材料与方法 - 2 -
1.1 材料 - 2 -
1.1.1 实验动物 - 2 -
1.1.2 载体、菌株和分子克隆相关试剂 - 3 -
1.1.3 主要试剂和抗体 - 3 -
1.1.4 主要设备和软件 - 3 -
1.1.5 引物 - 4 -
1.2 方法 - 4 -
1.2.1 M1及M2型骨髓来源巨噬细胞的诱导 - 4 -
1.2.2 人外周血单核细胞来源M1/M2型巨噬细胞诱导 - 5 -
1.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞的分离 - 5 -
1.2.4 细胞总RNA抽提，cDNA制备及定量PCR - 5 -
1.2.5 MA-1过表达载体的构建 - 6 -
1.2.6 质粒在M1型巨噬细胞中的转染 - 6 -
1.2.7 M2型巨噬细胞中MA-1 siRNA转染 - 7 -
1.2.8 Western Blot检测MA-1表达量 - 7 -
1.2.9 统计学处理 - 7 -
2 结果与分析 - 7 -
2.1 过表达质粒pCMV Tag2b-MA-1的构建 - 7 -
2.1.1 MA-1全长基因T载体的构建 - 7 -
2.1.2 过表达质粒pCMV Tag2b-MA-1的构建 - 8 -
2.2 转录因子MA-1在M2型巨 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
噬细胞中相对高表达 - 8 -
2.3 MA-1在M1中过表达，M1型巨噬细胞相关基因表达下降 - 9 -
2.4 MA-1在M2中敲除，M2型巨噬细胞相关基因表达下降 - 10 -
3 讨论 - 11 -
致谢 - 11 -
参考文献： - 12 -
附录 - 13 -
转录因子MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用
引言
巨噬细胞是一类免疫细胞，对于病原体感染或组织损害引起的炎症十分重要[1]。研究证实巨噬细胞具有相当大的可塑性，使其对环境信号产生有效应答，改变其表型及生理功能从而对细胞因子及微生物刺激做出应答[2]。这些改变产生了具有不同功能的巨噬细胞亚型，其表型分别以产生前炎性和抗炎细胞因子为特征[3]。在T helper-1 (Th-1)， T helper-2 (Th-2)分化这一概念的基础上[4]，巨噬细胞被分为经典激活的巨噬细胞（Classical Activated Marcophage，M1）（产生前炎性细胞因子，抵抗病原体，参与组织损害）和选择激活的巨噬细胞（Alternated Activated Macrophage，M2）（产生抗炎细胞因子，促进组织修复与重塑）[3, 5]。
一系列起决定作用的转录因子的活化是T细胞亚群的特征：如T-bet与Th-1有关，GATA-3与Th-2有关，Foxp3与Treg有关，RORγt与Th17有关[6]。树突状细胞（Dendritic Cell，DC）发挥作用需要转录因子IRF4和IRF8参与。CD4+ DC高表达IRF4，而浆细胞样DC低表达IRF4。因此，irf4-/-小鼠缺乏CD4+ DC。相反，浆细胞样DC和CD8+ DC高表达IRF8，因此，irf8-/-小鼠缺乏这些DC亚群[7]。近年来，许多研究小组致力于寻找调控巨噬细胞极化的转录因子，并取得了一定进展。研究证实转录因子NF-kB亚基p50激活抑制M1型巨噬细胞极化相关基因[8]，而转录因子C/EBPβ上调M2型巨噬细胞特异性基因[9]，IRF4通过刺激M2型巨噬细胞特异性标志分子的表达调控M2型巨噬细胞的极化[10]。
MA-1（Macrophage associated factor 1）是一种锌指转录因子，具有4个Kru¨ppel样锌指结构，且结构在哺乳动物进化中高度保守[11]。MA-1最初在人类细胞中被克隆，并被认为是一个转录抑制因子，可以结合到GC富集的启动子上。目前的研究也提示该基因可能作为转录抑制因子调控下游靶基因[12, 13]。已经显示MA-1广泛性低表达，但在胎盘及成人肾脏、肝脏和淋巴细胞中相对高表达[12]。一些研究已经提示MA-1在调控干细胞多潜能性和发育过程中发挥着功能。首先，一项较早的研究利用转录组分析检测了人胚胎干细胞（Embryo Stem Cells，ESCs）及其分化细胞，该研究认为MA-1在未分化的人ESCs中相对高表达，随着ESCs分化表达降低[14]。MA-1通过直接调节特定靶基因来控制胚胎干细胞的多能性，它是Nanog的一个重要互作分子[15]，也是Oct4和Sox2的互作分子[16]。其次，一项在结肠直肠癌细胞及人胚肾细胞中关于c-Myc相关蛋白的研究认为，MA-1是c-Myc的一个互作成员[17]。c-Myc是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
编码对于干细胞维持[18]及诱导多潜能性[19]的转录因子的致癌基因。再次，MA-1已经被认为是皮肤microRNA-203的候选靶基因，microRNA-203促进上皮分化，抑制干性[20]。这些提示MA-1可能在成年干细胞维持及皮肤发育中发挥中重要作用。第四，SOX4是一个重要的发育转录因子，在多种组织中控制分化及增殖，并在很多癌症类型中异常表达[21]。用ChIP及ChIP-chip分析人前列腺癌细胞SOX4转录网络，结果显示MA-1是SOX4的直接转录靶点。综上所述，MA-1很可能在细胞增殖、分化、肿瘤形成、干细胞维持、胚胎形成及发育中发挥着多种功能。但是，有关MA-1组织表达谱研究显示MA-1除了在未分化的ESCs中高表达，在小鼠及人一些成体组织中也较高表达，如肾脏、肝脏和淋巴细胞等[12]。这提示MA-1可能在一些成体组织或器官中发挥作用。
本研究证明了MA-1在M1/M2型巨噬细胞极化中的作用。MA-1在M1型巨噬细胞中低表达，M2型巨噬细胞中相对高表达。在M1型巨噬细胞中过表达MA-1可抑制M1特异性细胞因子的表达。相反，M2型巨噬细胞中干扰MA-1和MA-1敲除小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中显示M2型特异性标志分子表达受损。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自上海斯莱克动物有限公司，饲养于浙江大学实验动物中心SPF级环境。
1.1.2 载体、菌株和分子克隆相关试剂
pCMV tag2b（图1）购自Agilent公司。大肠杆菌DH5α由本实验室常规保存。琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司。DNA回收试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Axygen。无内毒素质粒抽提试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司。Endo-free Plamid midi Kit购自QIAGEN公司。细胞总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen。Taq聚合酶，pMD 18-T Simple Vector，逆转录试剂盒，实时荧光定量PCR检测试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自Takara。高保真PCR聚合酶KOD-Plus-Neo来自Toyobo。T4 DNA连接酶，限制性内切酶EcoRV， HindIII购自NEB。
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