用crisprcas9系统建立ago2基因敲除细胞系
Argonaute(Ago)蛋白是RISC的重要组成部分，通过miRNA介导完成对mRNA的剪切。Ago蛋白具有不同的亚族，在人类细胞中只有包含Ago2蛋白的RISC具有剪切靶基因的活性。为研究Ago2蛋白表达水平下降对细胞的影响，用CRISPR-Cas9系统构建Ago2基因敲除细胞系。本论文的主要工作是用重叠延伸PCR的方法构建含有sgAgo2序列的DNA片段，进一步连接到pSuper-7T载体上，利用LipofectamineTM 2000转染HeLa细胞，用blasticidin进行药物筛选，建立稳定转染的Ago2基因敲除细胞系。实验结果表明pU6-sgAgo2构建成功，稳定转染的HeLa细胞系基本建立，为进一步体外研究Ago2基因敲除细胞系奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料3
1.1.1 细胞与质粒3
1.1.2 实验仪器及耗材3
1.1.3 实验主要试剂3
1.2 实验方法4
1.2.1 构建pU6sgAgo24
1.2.1.1 引物设计4
1.2.1.2 重叠延伸PCR4
1.2.1.3 PCR产物凝胶电泳回收5
1.2.1.4 PCR产物3双酶切5
1.2.1.5 酶切产物与质粒的连接5
1.2.1.6 连接质粒转化大肠杆菌5
1.2.1.7 阳性转化细菌的挑选与鉴定6
1.2.1.8 质粒提取6
1.2.1.9 重组质粒测序鉴定7
1.2.2 培养稳定生长的细胞系7
1.2.2.1 细胞复苏7
1.2.2.2 细胞传代7
1.2.3细胞转染及稳定细胞系筛选7
2 结果与分析8
2.1 PCR产物分析8
2．2 阳性菌的挑选及菌落PCR验证8
2.3 测序结果9
2.4 转染细胞筛选结果10
3 讨论11
致谢12 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
参考文献12
用CRISPRCas9系统建立Ago2基因敲除细胞系
引言
Argonaute(Ago)蛋白是一类庞大的蛋白质家族，在不同的动物、植物中具有众多亚型，如线虫中的RDE1、ALG1、ALG2、SAGO1、SAGO2 [13]，拟南芥中的AGO1、AGO4、AGO6、AGO7[45]等。哺乳动物中的Ago蛋白包含4种亚家族成员Ago1Ago4，不同的Ago蛋白会与不同的miRNAs相互作用[6]。microRNAs是一类在多细胞生物中广泛表达、大小为22个核苷酸(nt)左右的非编码RNAs[78]。由初始miRNA在细胞核内翻译，之后再经Drosha和Dicer的酶切作用和RNA腺苷脱氨酶（adenosine deaminases that act on RNA，ADARs）等的进一步修饰，最终转运到细胞质中形成成熟的miRNA[9]。miRNA作为调控原件，主要参与细胞增殖、细胞凋亡、调节代谢等生理过程[1012]。Ago蛋白在动植物中与miRNA结合形成一个核糖核蛋白复合体，称为RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）。早期研究发现，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的RDE1蛋白在基因沉默中发挥必不可少的作用，从此研究者们将Argonaute蛋白家族与RNA干扰(RNA interference，RNAi)联系起来[7]。随后的研究发现，RISC通过对mRNA的剪切和抑制翻译来完成基因沉默[13]。miRNA分子与Ago蛋白形成一个复合体，然后结合靶基因mRNA位于3’ 非编码区的部分互补序列，从而降低靶基因的蛋白质翻译水平和/或mRNA表达水平[7,14]。或者miRNA特异性地识别特定的mRNA序列，二者可以形成足够的碱基配对，那么RISC将对mRNA进行剪切，Bartel发现在动物中有84%以上的的蛋白水平下降主要通过microRNA使目标mRNA被降解来发挥作用，而不是通过抑制它们的翻译[15]。
Argonaute蛋白家族中的所有蛋白质都有两个最重要的功能结构域：位于中心的PAZ结构域和位于C端的Piwi结构域。PAZ结构域主要介导RISC中Ago与miRNA的直接相互作用，Piwi结构域与RNA水解酶RNase H家族有极高同源性。因此，Argonaute蛋白是RISC中催化降解mRNA的活性蛋白，而这种活性来源于Piwi结构域[16]。尽管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi结构域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，在人体中只有Ago2蛋白参与RISCs对于目标mRNA的切割过程，而Ago1、 Ago3和Ago4则不具备这个功能。在人体中，Ago2与所有的miRNAs结合，进而抑制miRNA靶基因的表达[7,8,17]。相关研究结果表明，Ago2可差异性地调节miRNAs的表达，进而抑制人的肺癌细胞系在体外和小鼠内的生长[18]。通过实时定量PCR和免疫组化技术, 可以确定Ago在人类肺癌组织中表达下降[19]。这些研究结果揭示了Ago2蛋白调节mRNA表达和细胞生长的新功能和一个可能抑制肿瘤发生的新机制。因此，研究Ago2蛋白水平的升高或下降在其对细胞的影响，尤其是在人类癌症中的表达，可能会对癌症等疾病发生和治疗具有重要的意义。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)来自微生物的免疫系统，是微生物核酸酶系统参与防御入侵的噬菌体和质粒的方式。CRISPR位于微生物宿主中，包含一个CRISPR相关联的基因(Cas)和非编码RNA原件，二者组合能够特异性地介导核酸的酶解，CRISPRCas9系统是2013年报道的最新的基因剪辑技术[2022]，可作用于多种细胞。如图1所示，CRISPRCas9系统主要包含Cas9核酸酶(黄色)和靶点特异性的RNA(singleguide RNA，sgRNA)。Cas9核酸酶通过sgRNA靶向作用于基因组DNA上。sgRNA由20nt的导向序列(蓝色)和一个不变的框架序列(红色)组成，与双链DNA上5’NAA(PAM)之前的20nt互补配对，进而引导Cas9核酸酶到达基因组的具体靶点，对特定基因位点进行切割导致突变[23]。CRISPRCas9系统只利用一种酶，对生物的DNA序列进行修剪、切断、替换或添加，被普遍地用于快速高效地产生功能性缺失的基因型，相当于基因敲除，以便于进一步研究基因在细胞和体内的作用。整个CRISPRCas9系统中只需改变20nt RNA的向导序列即可改变基因剪辑的特异性，因此使用方便、适用性强，具有通用性且精确高效[24]。
图1 CRISPRCas9核酸酶系统
Argonaute蛋白通过RISC参与调控调控生物体中各种各样的生理过程, 目前的一些研究表明microRNA与人类的多种疾病如癌症密切相关[8,2527]，然而我们更感兴趣的是Ago2是否在miRNA调控基因表达、肿瘤发生和演变等过程中发挥关键作用。因此，研究Ago蛋白对研究miRNA系统、一些疾病的生理过程及其作用机理对癌症的诊断、预后、治疗有重要的意义。目前在人体细胞中抑制Ago2表达的手段和效果有限，因为常用的方法是RNA干扰技术，但Ago2蛋白恰恰是RNA干扰所必须的[17]，所以RNA干扰条件下Ago2表达的下降不明显、不稳定。CRISPRCas9系统则提供了一个研究Ago2功能性缺失的有效手段。本文中用CRISPRCas9系统建立稳定的Ago2基因敲除细胞系，以便于用该细胞系进一步研究Ago2基因缺失对人的不同细胞的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料3
1.1.1 细胞与质粒3
1.1.2 实验仪器及耗材3
1.1.3 实验主要试剂3
1.2 实验方法4
1.2.1 构建pU6sgAgo24
1.2.1.1 引物设计4
1.2.1.2 重叠延伸PCR4
1.2.1.3 PCR产物凝胶电泳回收5
1.2.1.4 PCR产物3双酶切5
1.2.1.5 酶切产物与质粒的连接5
1.2.1.6 连接质粒转化大肠杆菌5
1.2.1.7 阳性转化细菌的挑选与鉴定6
1.2.1.8 质粒提取6
1.2.1.9 重组质粒测序鉴定7
1.2.2 培养稳定生长的细胞系7
1.2.2.1 细胞复苏7
1.2.2.2 细胞传代7
1.2.3细胞转染及稳定细胞系筛选7
2 结果与分析8
2.1 PCR产物分析8
2．2 阳性菌的挑选及菌落PCR验证8
2.3 测序结果9
2.4 转染细胞筛选结果10
3 讨论11
致谢12 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
参考文献12
用CRISPRCas9系统建立Ago2基因敲除细胞系
引言
Argonaute(Ago)蛋白是一类庞大的蛋白质家族，在不同的动物、植物中具有众多亚型，如线虫中的RDE1、ALG1、ALG2、SAGO1、SAGO2 [13]，拟南芥中的AGO1、AGO4、AGO6、AGO7[45]等。哺乳动物中的Ago蛋白包含4种亚家族成员Ago1Ago4，不同的Ago蛋白会与不同的miRNAs相互作用[6]。microRNAs是一类在多细胞生物中广泛表达、大小为22个核苷酸(nt)左右的非编码RNAs[78]。由初始miRNA在细胞核内翻译，之后再经Drosha和Dicer的酶切作用和RNA腺苷脱氨酶（adenosine deaminases that act on RNA，ADARs）等的进一步修饰，最终转运到细胞质中形成成熟的miRNA[9]。miRNA作为调控原件，主要参与细胞增殖、细胞凋亡、调节代谢等生理过程[1012]。Ago蛋白在动植物中与miRNA结合形成一个核糖核蛋白复合体，称为RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）。早期研究发现，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的RDE1蛋白在基因沉默中发挥必不可少的作用，从此研究者们将Argonaute蛋白家族与RNA干扰(RNA interference，RNAi)联系起来[7]。随后的研究发现，RISC通过对mRNA的剪切和抑制翻译来完成基因沉默[13]。miRNA分子与Ago蛋白形成一个复合体，然后结合靶基因mRNA位于3’ 非编码区的部分互补序列，从而降低靶基因的蛋白质翻译水平和/或mRNA表达水平[7,14]。或者miRNA特异性地识别特定的mRNA序列，二者可以形成足够的碱基配对，那么RISC将对mRNA进行剪切，Bartel发现在动物中有84%以上的的蛋白水平下降主要通过microRNA使目标mRNA被降解来发挥作用，而不是通过抑制它们的翻译[15]。
Argonaute蛋白家族中的所有蛋白质都有两个最重要的功能结构域：位于中心的PAZ结构域和位于C端的Piwi结构域。PAZ结构域主要介导RISC中Ago与miRNA的直接相互作用，Piwi结构域与RNA水解酶RNase H家族有极高同源性。因此，Argonaute蛋白是RISC中催化降解mRNA的活性蛋白，而这种活性来源于Piwi结构域[16]。尽管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi结构域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，在人体中只有Ago2蛋白参与RISCs对于目标mRNA的切割过程，而Ago1、 Ago3和Ago4则不具备这个功能。在人体中，Ago2与所有的miRNAs结合，进而抑制miRNA靶基因的表达[7,8,17]。相关研究结果表明，Ago2可差异性地调节miRNAs的表达，进而抑制人的肺癌细胞系在体外和小鼠内的生长[18]。通过实时定量PCR和免疫组化技术, 可以确定Ago在人类肺癌组织中表达下降[19]。这些研究结果揭示了Ago2蛋白调节mRNA表达和细胞生长的新功能和一个可能抑制肿瘤发生的新机制。因此，研究Ago2蛋白水平的升高或下降在其对细胞的影响，尤其是在人类癌症中的表达，可能会对癌症等疾病发生和治疗具有重要的意义。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)来自微生物的免疫系统，是微生物核酸酶系统参与防御入侵的噬菌体和质粒的方式。CRISPR位于微生物宿主中，包含一个CRISPR相关联的基因(Cas)和非编码RNA原件，二者组合能够特异性地介导核酸的酶解，CRISPRCas9系统是2013年报道的最新的基因剪辑技术[2022]，可作用于多种细胞。如图1所示，CRISPRCas9系统主要包含Cas9核酸酶(黄色)和靶点特异性的RNA(singleguide RNA，sgRNA)。Cas9核酸酶通过sgRNA靶向作用于基因组DNA上。sgRNA由20nt的导向序列(蓝色)和一个不变的框架序列(红色)组成，与双链DNA上5’NAA(PAM)之前的20nt互补配对，进而引导Cas9核酸酶到达基因组的具体靶点，对特定基因位点进行切割导致突变[23]。CRISPRCas9系统只利用一种酶，对生物的DNA序列进行修剪、切断、替换或添加，被普遍地用于快速高效地产生功能性缺失的基因型，相当于基因敲除，以便于进一步研究基因在细胞和体内的作用。整个CRISPRCas9系统中只需改变20nt RNA的向导序列即可改变基因剪辑的特异性，因此使用方便、适用性强，具有通用性且精确高效[24]。
图1 CRISPRCas9核酸酶系统
Argonaute蛋白通过RISC参与调控调控生物体中各种各样的生理过程, 目前的一些研究表明microRNA与人类的多种疾病如癌症密切相关[8,2527]，然而我们更感兴趣的是Ago2是否在miRNA调控基因表达、肿瘤发生和演变等过程中发挥关键作用。因此，研究Ago蛋白对研究miRNA系统、一些疾病的生理过程及其作用机理对癌症的诊断、预后、治疗有重要的意义。目前在人体细胞中抑制Ago2表达的手段和效果有限，因为常用的方法是RNA干扰技术，但Ago2蛋白恰恰是RNA干扰所必须的[17]，所以RNA干扰条件下Ago2表达的下降不明显、不稳定。CRISPRCas9系统则提供了一个研究Ago2功能性缺失的有效手段。本文中用CRISPRCas9系统建立稳定的Ago2基因敲除细胞系，以便于用该细胞系进一步研究Ago2基因缺失对人的不同细胞的影响。
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