DNA双链断裂修复关键激酶Tel1的基本结构及与底物的相互作用
DNA双链断裂修复关键激酶Tel1的基本结构及与底物的相互作用[20200614171522]
摘要：近几年，低温电镜（cryo-EM）在研究生物结构的过程中得到广泛应用。低温电镜的优点在于，能够在维持生物材料的生理状态下得到高分辨率的电镜显微图像。利用单颗粒分析方法(single particle analysis, SPA)对得到的电镜显微图像进行分析处理，得到信噪比较高的二维图像，进一步可重构出样品的三维结构。ATM（Ataxia telangiectasia mutated）蛋白激酶是高等真核细胞中起始DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）修复的重要激酶，通过调控下游蛋白的磷酸化来维持染色体稳定。在裂殖酵母中，Tel1与高等真核类ATM具有高度同源性，对DNA双链断裂修复具有重要调控作用。本课题通过串联亲和层析（Tandem Affinity Purification, TAP）的方法得到较高纯度的Tel1，在低温电镜下观察到Tel1二聚体具有不同的构象，这种构象的变化可能与Tel1所处的不同激活状态有关。将纯化后的Tel1与其底物Ccq1结合后发现Tel1二聚体的构象发生变化，并且通过Xmipp软件进行二维分析加以直观显示。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:低温电镜；单颗粒分析；Tel1；DNA双链断裂；串联亲和层析；
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
第一章 实验材料与方法 5
1.1 实验仪器与材料 5
1.1.1 实验仪器 5
1.1.2 实验材料 5
1.1.2.1 过表达Tel1蛋白的酵母克隆 5
1.1.2.2 表达Tel1作用底物Ccq1的重组质粒 5
1.2 酵母细胞的扩大培养准备 6
1.2.1 酵母培养基的配制 6
1.3 酵母细胞的扩大培养和收集 6
1.4 酵母目的蛋白Tel1的纯化 7
1.4.1 IgG亲和层析纯化Tel1蛋白 7
1.4.2 Tel1蛋白纯化结果检测 8
1.4.2.1 Ruby Stain检测法检测纯化后的Tel1蛋白情况 8
1.4.2.2 Western Blotting追踪纯化过程中Tel1蛋白得率 9
1.5 重组表达与Tel1相互作用底物Ccq1 9
1.5.1 转化大肠SOB(super optimal broth)培养基的配制 9
1.5.2 Inoue法制备大肠杆菌克隆载体Top10与表达载体BL21感受态细胞 10
1.5.3 重组质粒转入感受态细胞 10
1.5.4 大肠杆菌细胞的诱导表达和收集 11
1.5.4.1 确定最适IPTG诱导浓度 11
1.5.4.3 Ni柱纯化重组表达蛋白Ccq1-6His 11
1.5.4.4 重组蛋白纯化效果的检测 12 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
/> 1.5.5 离子交换层析纯化重组蛋白 12
1.5.6 分子筛进一步纯化重组蛋白 13
1.5.7 Tel1与其底物Ccq1相互作用 14
1.6 电镜观察和分析 14
1.6.1 电镜样品的制备 14
1.6.2 低温电镜的基本操作与观察 14
1.6.3 单颗粒电镜结果的初步分析 14
第二章 Tel1的纯化与电镜分析 15
2.1 检测TAP-Tel1的表达信号 15
2.2 Tel1纯化效果与电镜结果分析 15
第三章Tel1 功能研究的初步探索和分析 19
3.1 纯化Tel1底物Ccq1-6His 19
3.1.1 检测pCold I-Ccq1质粒转化情况并确定最适IPTG诱导浓度 19
3.1.2 检测重组蛋白的Ni柱纯化结果 19
3.1.3 检测离子交换层析法分离效果 20
3.1.4 检测分子筛的分离效果 22
3.2 电镜观察Tel1与其底物Ccq1相互作用的效果 23
第四章 讨论与展望 26
致谢 27
参考文献 28
DNA双链断裂修复关键激酶Tel1的基本结构及与底物的相互作用
摘要：近几年，低温电镜（cryo-EM）在研究生物结构的过程中得到广泛应用。低温电镜的优点在于，能够在维持生物材料的生理状态下得到高分辨率的电镜显微图像。利用单颗粒分析方法(single particle analysis, SPA)对得到的电镜显微图像进行分析处理，得到信噪比较高的二维图像，进一步可重构出样品的三维结构。ATM（Ataxia telangiectasia mutated）蛋白激酶是高等真核细胞中起始DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）修复的重要激酶，通过调控下游蛋白的磷酸化来维持染色体稳定。在裂殖酵母中，Tel1与高等真核类ATM具有高度同源性，对DNA双链断裂修复具有重要调控作用。本课题通过串联亲和层析（Tandem Affinity Purification, TAP）的方法得到较高纯度的Tel1，在低温电镜下观察到Tel1二聚体具有不同的构象，这种构象的变化可能与Tel1所处的不同激活状态有关。将纯化后的Tel1与其底物Ccq1结合后发现Tel1二聚体的构象发生变化，并且通过Xmipp软件进行二维分析加以直观显示。
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关键字:低温电镜；单颗粒分析；Tel1；DNA双链断裂；串联亲和层析；
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摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
第一章 实验材料与方法 5
1.1 实验仪器与材料 5
1.1.1 实验仪器 5
1.1.2 实验材料 5
1.1.2.1 过表达Tel1蛋白的酵母克隆 5
1.1.2.2 表达Tel1作用底物Ccq1的重组质粒 5
1.2 酵母细胞的扩大培养准备 6
1.2.1 酵母培养基的配制 6
1.3 酵母细胞的扩大培养和收集 6
1.4 酵母目的蛋白Tel1的纯化 7
1.4.1 IgG亲和层析纯化Tel1蛋白 7
1.4.2 Tel1蛋白纯化结果检测 8
1.4.2.1 Ruby Stain检测法检测纯化后的Tel1蛋白情况 8
1.4.2.2 Western Blotting追踪纯化过程中Tel1蛋白得率 9
1.5 重组表达与Tel1相互作用底物Ccq1 9
1.5.1 转化大肠SOB(super optimal broth)培养基的配制 9
1.5.2 Inoue法制备大肠杆菌克隆载体Top10与表达载体BL21感受态细胞 10
1.5.3 重组质粒转入感受态细胞 10
1.5.4 大肠杆菌细胞的诱导表达和收集 11
1.5.4.1 确定最适IPTG诱导浓度 11
1.5.4.3 Ni柱纯化重组表达蛋白Ccq1-6His 11
1.5.4.4 重组蛋白纯化效果的检测 12
/> 1.5.5 离子交换层析纯化重组蛋白 12
1.5.6 分子筛进一步纯化重组蛋白 13
1.5.7 Tel1与其底物Ccq1相互作用 14
1.6 电镜观察和分析 14
1.6.1 电镜样品的制备 14
1.6.2 低温电镜的基本操作与观察 14
1.6.3 单颗粒电镜结果的初步分析 14
第二章 Tel1的纯化与电镜分析 15
2.1 检测TAP-Tel1的表达信号 15
2.2 Tel1纯化效果与电镜结果分析 15
第三章Tel1 功能研究的初步探索和分析 19
3.1 纯化Tel1底物Ccq1-6His 19
3.1.1 检测pCold I-Ccq1质粒转化情况并确定最适IPTG诱导浓度 19
3.1.2 检测重组蛋白的Ni柱纯化结果 19
3.1.3 检测离子交换层析法分离效果 20
3.1.4 检测分子筛的分离效果 22
3.2 电镜观察Tel1与其底物Ccq1相互作用的效果 23
第四章 讨论与展望 26
致谢 27
参考文献 28
DNA双链断裂修复关键激酶Tel1的基本结构及与底物的相互作用
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