dna甲基化调节拟南芥耐寒多态性的研究
：本研究使用模式植物拟南芥作为材料，研究了DNA甲基化在拟南芥耐寒多态性中的作用。结果表明，不同拟南芥种群耐寒性存在显著差异，拟南芥耐冷性与耐冷基因甲基化数目成负相关。CBF通路在拟南芥耐寒性中发挥关键作用，耐冷种群（Gy-0 和 Per-1）中ICE1、CBF1、CBF3、COR15a和COR47的表达量显著高于冷敏感（Wa-1 和 Ms-0）,而CBF2作为负调节基因在拟南芥种群中具有相反的表达模式。去甲基化试剂5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine）处理后的植株低温半致死温度显著降低，抗寒能力增强。除此之外，基因相对表达量分析结果显示，受到去甲基化处理的植株，其冷响应基因ICE1、CBF1、CBF3、COR15a和COR47表达量均上升。这表明DNA去甲基化将有助于拟南芥更加快速、高效地表达耐冷基因，来应对低温胁迫。本研究以ICE1基因等耐冷基因甲基化为例，阐述了DNA甲基化在拟南芥耐寒多态性中的作用，以期为耐冷基因的利用及植物耐冷遗传改良和育种提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法4
1.1拟南芥耐寒性的测定4
1.1.1实验材料 4
1.1.2实验试剂4
1.1.3主要实验仪器4
1.1.4实验方法4
1.2冷响应基因的表达量分析 4
1.2.1实验材料 4
1.2.2实验试剂4
1.2.3主要实验仪器5
1.2.4实验方法5
1.3甲基化程度的确定6
1.3.1实验材料 6
1.3.2实验试剂6
1.3.3主要实验仪器6
1.3.4实验方法6
2结果与分析8
2.1拟南芥耐寒性状的测定、甲基化位点检测及相关性分析8
2.2四个典型种群中CBF通路基因表达量分析 10
2.3去甲基化对四个典型种群的影响12
3讨论16
致谢17
参考文献17
DNA甲基化调节拟南芥耐寒多态性的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
研究
引言
引言
低温作为一类非生物胁迫，对植物的生长，发育，开花结果等生理过程有着巨大影响。低温所造成的植物冻伤，脱水，甚至死亡等危害，长期以来给人类的生产生活造成了极大的限制[1]。研究低温胁迫下植物的生理生化状况、分子机理及耐寒响应，对植物抗逆育种，作物增产增收有着重要意义。
目前国内外主要采用拟南芥作为材料来研究低温胁迫对植物的影响。拟南芥作为模式植物，其低温应答调控网络的研究较为充分，主要包括ABA依赖途径以及ABA非依赖途径。在ABA依赖途径中，bZIP类转录因子通过与含有ABA应答元件（ABRE）的基因作用，介导下启动植物抗寒基因，从而增加植物抗寒性。ABA非依赖途径主要包括ICE1和CBF（也称作DREB）等重要组分。该信号通路为：ICE1转录因子识别ICE1盒后，激活CBF转录因子，从而进一步识别CRT/DREB基序以激活抗寒基因表达。ICE1为一类组成型表达的转录因子，受低温诱导，并能与CBF3启动子的MYC顺式元件结合，驱动该基因的表达。ICE1表达的缺失会导致大量的COR基因无法响应低温胁迫而表达。相当一部分上述转录因子的启动子区域具有能与ICE1结合的元件，由此可知ICE1在低温响应调控中是一类关键因子。
CBF作为一类反式作用因子，能与下游耐冷基因结合，从而激活植物耐冷响应通路。CBF冷响应通路作为ABA非依赖型通路，具有大量的下游响应基因。这些响应基因往往直接与植物耐冷性相关，如去除活性氧，稳定细胞膜结构等，由此可见CBF通路在植物耐冷基因网络中的重要作用[2]。CBF蛋白家族有一个保守的DNA结合域AP2/ERF结构域，约有60个氨基酸[3]。三维结构分析发现，该结构域有三股由α螺旋连接的反向平行的β折叠[4]。在许多植物品系中，CBF基因的表达大多呈现先上升再下降的趋势，并且在1到4小时内达到峰值。冷害胁迫下，拟南芥的CBF3、CBF1以及CBF2基因表达均升高，而在其他胁迫状况下并无明显上调[5]。在许多冷诱导基因的启动子区有一段保守的序列DRE，含有AP2 DNA结合结构域的CBF蛋白，可以特异性地结合到该序列上，并激活该序列所驱动的基因的表达[6]。除了DRE顺式作用元件，ICE1基因、HOS1基因、MYB15基因都是CBF基因及其下游基因的直接调节子。例如，在拟南芥中，ICE1突变体将无法上调CBF3及COR，使得该植株的耐冷能力显著降低[7]。有研究表明，在拟南芥体内过表达CBF1，将诱导cor6.6,cor15a,cor47以及cor78的表达，从而提高未经冷驯化的植株的耐冷性[8]。除此之外，在拟南芥中过表达35S CaMV 或rd29A启动子的CBF3，也会使得其抗寒性得到提高[9]。
表观遗传学是指在不涉及基因序列变化的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。其主要现象包括DNA甲基化、小分子RNA以及基因组印迹等等。就植物逆境胁迫研究领域来说，表观遗传学研究方法与理念的应用给该领域带来了更多的突破。DNA甲基化作为一种表观遗传学修饰能在DNA水平对基因表达进行调控。DNA甲基转移酶能够转移甲基。通过这种方式，DNA得到相应修饰以调节基因的表达。5氮杂胞嘧啶核苷（5azacytidine）能抑制DNA甲基转移酶的活性，从而引起DNA去甲基化或半去甲基化。所以5氮杂胞嘧啶核苷常常作为一类去甲基化试剂在科学研究中广泛使用。
作为一类不可以自由移动的生物，植物常常需要调节自身的生理状况来应对不同的环境变化。除此之外，由于种子传播距离有限，下一代面临的环境往往与亲代类似。由此，一类逆境往往会连续对几代植物造成胁迫。在这种情况下，一类不涉及DNA序列变化的、能调节基因表达的、可逆的表观遗传修饰机制往往会被遗传[10]。研究发现，绝大多数的生物性与非生物性胁迫通过改变减数分裂与有丝分裂中同源重组的几率来改变基因组的稳定性。除此之外，这类逆境胁迫引起的同源重组几率的提高可以被遗传[11]。通过研究大量植物品种与环境的关系，研究人员发现植物跨代的抗逆锻炼与表观遗传修饰相关。例如，将种子成熟期的拟南芥暴露在冷胁迫条件中，其下一代植株的耐冷性会得到提高[12]。
正由于表观遗传学相关机制与可遗传的表等位基因以及转座子调控有关，其在抗逆遗传育种领域将有重要的应用价值[13]。在植物体内，DNA胞嘧啶的甲基化主要在三种序列中：CG,CHG以及CHH。其中H代表A,C或T。一般来说，基因的甲基化程度越高，其空间位阻越大，转录相关复合物无法靠近该基因进行转录，从而使该基因表达水平下降。Akimoto等研究发现，对水稻幼苗施以DNA甲基转移酶抑制剂azacytidine，几代以后的某个株系获得了抗病菌的能力(Xanthomonas oryzae)。进一步研究发现，这与其抗性基因启动子的低甲基化程度有关。这说明，降低抗性基因的甲基化程度将有助于提高逆境胁迫下植株的抗性[14]。。转座现象作为在表观遗传领域较早发现的现象，在逆境胁迫的表观调控方面有着重要意义。研究发现，转座子作为一类可以移动的基因序列，能够调节基因表达。转座子可以产生大量的转录抑制子小分子RNA,从而来调节胁迫响应基因的表达。逆境胁迫下，植物通过产生这类可以移动的小分子RNA，来调控较远处的组织结构中基因的表达，以达到增强抗逆性的目的[15]。转座子调控植物抗逆的机制还需要进一步探索，以期能在未来的植物遗传育种领域得到应用。
DNA甲基化是一类重要的表观遗传学修饰，在真核生物中广泛地存。在DNA甲基转移酶的作用下，S腺苷甲硫氨酸（Sdaomet, SAM）的甲基基团被转移到转移到胞嘧啶（C）上，形成5甲基胞嘧啶（5mC）。被甲基化修饰过的DNA序列由于结构的改变，从而影响到了与蛋白质的相互作用，使相关基因的表达受到了抑制[16]。DNA甲基化作为一种调控基因表达的遗传修饰，在植物的生长发育、应对胁迫等方面有着重要的作用。逆境胁迫条件下，DNA甲基化水平的变化可以很好地调节抗逆基因的表达。当植物面对胁迫时，抗性基因DNA甲基化程度的降低有助于该类基因的大量表达。基于此，植物往往会产生一定的生理变化，比如激活活性氧清除系统，积累渗透调节物质等，来帮助自身应对逆境胁迫。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法4
1.1拟南芥耐寒性的测定4
1.1.1实验材料 4
1.1.2实验试剂4
1.1.3主要实验仪器4
1.1.4实验方法4
1.2冷响应基因的表达量分析 4
1.2.1实验材料 4
1.2.2实验试剂4
1.2.3主要实验仪器5
1.2.4实验方法5
1.3甲基化程度的确定6
1.3.1实验材料 6
1.3.2实验试剂6
1.3.3主要实验仪器6
1.3.4实验方法6
2结果与分析8
2.1拟南芥耐寒性状的测定、甲基化位点检测及相关性分析8
2.2四个典型种群中CBF通路基因表达量分析 10
2.3去甲基化对四个典型种群的影响12
3讨论16
致谢17
参考文献17
DNA甲基化调节拟南芥耐寒多态性的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
研究
引言
引言
低温作为一类非生物胁迫，对植物的生长，发育，开花结果等生理过程有着巨大影响。低温所造成的植物冻伤，脱水，甚至死亡等危害，长期以来给人类的生产生活造成了极大的限制[1]。研究低温胁迫下植物的生理生化状况、分子机理及耐寒响应，对植物抗逆育种，作物增产增收有着重要意义。
目前国内外主要采用拟南芥作为材料来研究低温胁迫对植物的影响。拟南芥作为模式植物，其低温应答调控网络的研究较为充分，主要包括ABA依赖途径以及ABA非依赖途径。在ABA依赖途径中，bZIP类转录因子通过与含有ABA应答元件（ABRE）的基因作用，介导下启动植物抗寒基因，从而增加植物抗寒性。ABA非依赖途径主要包括ICE1和CBF（也称作DREB）等重要组分。该信号通路为：ICE1转录因子识别ICE1盒后，激活CBF转录因子，从而进一步识别CRT/DREB基序以激活抗寒基因表达。ICE1为一类组成型表达的转录因子，受低温诱导，并能与CBF3启动子的MYC顺式元件结合，驱动该基因的表达。ICE1表达的缺失会导致大量的COR基因无法响应低温胁迫而表达。相当一部分上述转录因子的启动子区域具有能与ICE1结合的元件，由此可知ICE1在低温响应调控中是一类关键因子。
CBF作为一类反式作用因子，能与下游耐冷基因结合，从而激活植物耐冷响应通路。CBF冷响应通路作为ABA非依赖型通路，具有大量的下游响应基因。这些响应基因往往直接与植物耐冷性相关，如去除活性氧，稳定细胞膜结构等，由此可见CBF通路在植物耐冷基因网络中的重要作用[2]。CBF蛋白家族有一个保守的DNA结合域AP2/ERF结构域，约有60个氨基酸[3]。三维结构分析发现，该结构域有三股由α螺旋连接的反向平行的β折叠[4]。在许多植物品系中，CBF基因的表达大多呈现先上升再下降的趋势，并且在1到4小时内达到峰值。冷害胁迫下，拟南芥的CBF3、CBF1以及CBF2基因表达均升高，而在其他胁迫状况下并无明显上调[5]。在许多冷诱导基因的启动子区有一段保守的序列DRE，含有AP2 DNA结合结构域的CBF蛋白，可以特异性地结合到该序列上，并激活该序列所驱动的基因的表达[6]。除了DRE顺式作用元件，ICE1基因、HOS1基因、MYB15基因都是CBF基因及其下游基因的直接调节子。例如，在拟南芥中，ICE1突变体将无法上调CBF3及COR，使得该植株的耐冷能力显著降低[7]。有研究表明，在拟南芥体内过表达CBF1，将诱导cor6.6,cor15a,cor47以及cor78的表达，从而提高未经冷驯化的植株的耐冷性[8]。除此之外，在拟南芥中过表达35S CaMV 或rd29A启动子的CBF3，也会使得其抗寒性得到提高[9]。
表观遗传学是指在不涉及基因序列变化的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。其主要现象包括DNA甲基化、小分子RNA以及基因组印迹等等。就植物逆境胁迫研究领域来说，表观遗传学研究方法与理念的应用给该领域带来了更多的突破。DNA甲基化作为一种表观遗传学修饰能在DNA水平对基因表达进行调控。DNA甲基转移酶能够转移甲基。通过这种方式，DNA得到相应修饰以调节基因的表达。5氮杂胞嘧啶核苷（5azacytidine）能抑制DNA甲基转移酶的活性，从而引起DNA去甲基化或半去甲基化。所以5氮杂胞嘧啶核苷常常作为一类去甲基化试剂在科学研究中广泛使用。
作为一类不可以自由移动的生物，植物常常需要调节自身的生理状况来应对不同的环境变化。除此之外，由于种子传播距离有限，下一代面临的环境往往与亲代类似。由此，一类逆境往往会连续对几代植物造成胁迫。在这种情况下，一类不涉及DNA序列变化的、能调节基因表达的、可逆的表观遗传修饰机制往往会被遗传[10]。研究发现，绝大多数的生物性与非生物性胁迫通过改变减数分裂与有丝分裂中同源重组的几率来改变基因组的稳定性。除此之外，这类逆境胁迫引起的同源重组几率的提高可以被遗传[11]。通过研究大量植物品种与环境的关系，研究人员发现植物跨代的抗逆锻炼与表观遗传修饰相关。例如，将种子成熟期的拟南芥暴露在冷胁迫条件中，其下一代植株的耐冷性会得到提高[12]。
正由于表观遗传学相关机制与可遗传的表等位基因以及转座子调控有关，其在抗逆遗传育种领域将有重要的应用价值[13]。在植物体内，DNA胞嘧啶的甲基化主要在三种序列中：CG,CHG以及CHH。其中H代表A,C或T。一般来说，基因的甲基化程度越高，其空间位阻越大，转录相关复合物无法靠近该基因进行转录，从而使该基因表达水平下降。Akimoto等研究发现，对水稻幼苗施以DNA甲基转移酶抑制剂azacytidine，几代以后的某个株系获得了抗病菌的能力(Xanthomonas oryzae)。进一步研究发现，这与其抗性基因启动子的低甲基化程度有关。这说明，降低抗性基因的甲基化程度将有助于提高逆境胁迫下植株的抗性[14]。。转座现象作为在表观遗传领域较早发现的现象，在逆境胁迫的表观调控方面有着重要意义。研究发现，转座子作为一类可以移动的基因序列，能够调节基因表达。转座子可以产生大量的转录抑制子小分子RNA,从而来调节胁迫响应基因的表达。逆境胁迫下，植物通过产生这类可以移动的小分子RNA，来调控较远处的组织结构中基因的表达，以达到增强抗逆性的目的[15]。转座子调控植物抗逆的机制还需要进一步探索，以期能在未来的植物遗传育种领域得到应用。
DNA甲基化是一类重要的表观遗传学修饰，在真核生物中广泛地存。在DNA甲基转移酶的作用下，S腺苷甲硫氨酸（Sdaomet, SAM）的甲基基团被转移到转移到胞嘧啶（C）上，形成5甲基胞嘧啶（5mC）。被甲基化修饰过的DNA序列由于结构的改变，从而影响到了与蛋白质的相互作用，使相关基因的表达受到了抑制[16]。DNA甲基化作为一种调控基因表达的遗传修饰，在植物的生长发育、应对胁迫等方面有着重要的作用。逆境胁迫条件下，DNA甲基化水平的变化可以很好地调节抗逆基因的表达。当植物面对胁迫时，抗性基因DNA甲基化程度的降低有助于该类基因的大量表达。基于此，植物往往会产生一定的生理变化，比如激活活性氧清除系统，积累渗透调节物质等，来帮助自身应对逆境胁迫。
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