CFP10ESAT6融合蛋白的原核表达及纯化
CFP10ESAT6融合蛋白的原核表达及纯化[20200614171928]
摘要：目的：构建结核分枝杆菌（mycobacrerium tuberculosis,M.tb）CFP10-ESAT6融合基因原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达融合蛋白后，纯化融合蛋白。 方法：用实验室已构建好的pET-32a(+)-CFP10和pET-32a(+)-ESAT6的重组质粒作为模板，PCR法分别扩增出CFP10和ESAT6。然后，利用基因拼接法中的GeneSOEing基因拼接方法扩增得到CFP10 -ESAT6融合基因。将融合基因克隆至pET-28a(+)载体，得到pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组质粒后，转入E.coli BL21（DE3） PlySs，通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂诱导表达目的融合蛋白，再用亲和层析的方法纯化带有一个His-Tag的融合蛋白。 结果：成功构建了pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组质粒，基因测序结果与Genbank中序列一致。将重组质粒转化入大肠杆菌后，用IPTG诱导，经SDS-PAGE分析，相对分子质量约为22kD，蛋白质纯度达90％以上。 结论：成功构建了pET-28a(+)-CFP10-ESAT6原核表达质粒，并诱导表达出了融合蛋白，得到纯化的融合蛋白作为抗原，为后期制备鼠抗CFP10-ESAT6多克隆抗体奠定基础，同时为诊断致病性的M.tb感染提供新思路。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:结核分枝杆菌；培养滤液蛋白10；6kD早期分泌抗原靶；融合蛋白
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1质粒与菌株来源5
1.1.2工具酶和主要试剂5
1.2方法 5
1.2.1设计PCR引物5
1.2.2扩增CFP10-ESAT6融合基因6
1.2.3 CFP10-ESAT6融合基因原核表达质粒的构建及鉴定6
1.2.4 CFP10-ESAT6融合基因的小量诱导表达及最优条件摸索6
1.2.5 CFP10-ESAT6融合基因的大量诱导表达及纯化6
2结果与分析7
2.1 CFP10和ESAT6基因扩增产物的鉴定7
2.2 CFP10-ESAT6 融合基因扩增产物的鉴定7
2.3 重组表达质粒的鉴定7
2.4 CFP10-ESAT6 融合蛋白小量诱导表达及最优条件摸索8
2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白大量诱导表达及纯化9
3讨论 10
致谢11
参考文献12
CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及纯化
摘要：目的：构建结核分枝杆菌（mycobacrerium tuberculosis,M.tb）CFP10-ESAT6融合基因原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达融合蛋白后，纯化融合蛋白。 方法：用实验室已构建好的pET-32a(+)-CFP10和pET-32a(+)-ESAT6的重组质粒作为模板，PCR法分别扩增出CFP10和ESAT6。然后，利用基因拼接法中的GeneSOEing基因拼接方法扩增得到CFP10 -ESAT6融合基因。将融合基因克隆至pET-28a(+)载体，得到pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组质粒后，转入E.coli BL21（DE3） PlySs，通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂诱导表达目的融合蛋白，再用亲和层析的方法纯化带有一个His-Tag的融合蛋白。 结果：成功构建了pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组质粒，基因测序结果与Genbank中序列一致。将重组质粒转化入大肠杆菌后，用IPTG诱导，经SDS-PAGE分析，相对分子质量约为22kD，蛋白质纯度达90％以上。 结论：成功构建了pET-28a(+)-CFP10-ESAT6原核表达质粒，并诱导表达出了融合蛋白，得到纯化的融合蛋白作为抗原，为后期制备鼠抗CFP10-ESAT6多克隆抗体奠定基础，同时为诊断致病性的M.tb感染提供新思路。
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关键字:结核分枝杆菌；培养滤液蛋白10；6kD早期分泌抗原靶；融合蛋白
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1质粒与菌株来源5
1.1.2工具酶和主要试剂5
1.2方法 5
1.2.1设计PCR引物5
1.2.2扩增CFP10-ESAT6融合基因6
1.2.3 CFP10-ESAT6融合基因原核表达质粒的构建及鉴定6
1.2.4 CFP10-ESAT6融合基因的小量诱导表达及最优条件摸索6
1.2.5 CFP10-ESAT6融合基因的大量诱导表达及纯化6
2结果与分析7
2.1 CFP10和ESAT6基因扩增产物的鉴定7
2.2 CFP10-ESAT6 融合基因扩增产物的鉴定7
2.3 重组表达质粒的鉴定7
2.4 CFP10-ESAT6 融合蛋白小量诱导表达及最优条件摸索8
2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白大量诱导表达及纯化9
3讨论 10
致谢11
参考文献12
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