大豆abc（atpbindingcassette）转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究
ABC（ATP-Binding Cassette）转运蛋白是目前已知最大的蛋白质家族，其在生物进化中比较保守，功能之一为跨膜转运包括脂质在内的多种物质。但植物ABC转运蛋白与脂质合成和分泌的关系却少有报道。脂质的合成与分泌对生物的生存与理化反应有重要意义。脂质的合成与生物体内的物质运输有关，如脂质合成与囊泡的合成及运输之间相互作用，能够提升生物体内的物质运输效率。本项目从基因功能分析入手，成功克隆出了所需的大豆ABC转运蛋白编码基因，并且在敲除同类基因的酵母和拟南芥中表达，分析了该基因在油脂合成与分泌中的作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 目的基因克隆 2
1.2.2 重组质粒的构建 4
1.2.3 大豆目的基因在酵母中的功能验证 4
1.2.4 拟南芥的培育及目的基因在拟南芥中基因功能验证 4
1.2.5 在烟草中进行基因表达的亚细胞定位观察 5
2 结果与分析 5
2.1同源序列的查找 5
2.2基因克隆与载体构建 6
2.3酵母突变体回补实验 7
2.4拟南芥纯合体的筛选 10
3 讨论 12
3.1基因在酵母中的功能分析 12
3.2基因在拟南芥中的功能分析 13
致谢 13
参考文献 13
附录 14
大豆ABC（ATPBinding Cassette） 转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究
引言
ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒式转运蛋白(ATPbinding cassette transporters)，广泛存在于原核生物和真核生物中。在植物界，以大豆和拟南芥为代表的ABC转运蛋白家族多达120种以上。越来越多的证据表明真核细胞中ABC转运蛋白参与细胞膜脂质分子的转运[1]，目前对拟南芥及酵母中ABC转运蛋白家族及其作用机理研究基本透彻，而大豆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
中的ABC转运蛋白家族基因报道却比较少。
脂质的合成与分泌对生物的生存与理化反应有重要意义。首先，脂质的合成与生物体内的物质运输有关。如脂质合成与囊泡的合成及运输之间相互作用，能够提升生物体内的物质运输效率。同时，脂质可以保护生物、提高生物抗逆性。如植物叶片有角质层，主要成分为蜡质，可防止植物流失水分和抵抗微生物侵袭。对植物体内脂质的合成与分泌的研究具有非常重要的价值。
本研究拟在大豆中鉴定几个与脂质转运相关的ABC转运蛋白家族基因，以期为提高植物抗逆性和种子含油量奠定基础。此外，这方面的进一步研究将会对人类ABC转运蛋白的研究提供重要线索，并起到很大促进作用[2]。
目前已有证据表明酵母位于过氧化物酶体中的PXA1基因（基因座为YPL147w），PXA2基因[3]（基因座为YKL188c），位于质膜上的PDR5基因[4]（基因座为YOR153w），PDR11基因[5]（基因座为YIL013c）以及AUS1基因[6]（基因座为YOR011w）参与油脂形成与运输。
拟南芥中的ABC transporter基因对于酵母突变体恢复脂质代谢功能的重要作用：如克隆拟南芥中具有影响脂质分泌及代谢的ABC transporters家族中的一类基因CrMRP2，并转运入缺乏ScYCF1基因（影响酵母脂质代谢）的酵母突变体dty168Δ时，酵母突变体恢复了脂质代谢的活性[7]。
AtABCA9 transporter对于拟南芥的脂质合成及代谢的作用：在拟南芥的内质网上定位到了ABC transporter的家族基因AtABCA9，同时缺乏AtABCA9的拟南芥突变体种子的油脂含量下降达35%，该基因提供丰富的脂肪酸用于脂质代谢。[8]
种种证据表明研究ABC转运蛋白在脂质转运方面的功能是有实际意义并且完全可行的。
1 材料与方法
1.1 材料
本项目中所用的的酵母野生型为BY4741(MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体，BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体。野生型BY4742的突变体ybt1Δ由文献(Kailash Gulshan and W. Scott MoyeRowley.Vacuolar Import of Phosphatidylcholine Requires the ATPBinding Cassette Transporter Ybt1.2011.Trafic.12:12571268.)通讯作者Scott MoyeRowley实验室提供。BY4741野生型及突变体ybt1Δ和BY4742野生型由本院梁永恒教授实验室提供。
本项目中所用的拟南芥野生型为哥伦比亚0型，由本实验室自身提供。
1.2 方法
1.2.1 目的基因克隆
(1) 目的基因的选择
从Phytozome的数据库中通过blastp算法获得酵母Aus1、Ybt1、Pdr18三种ABC转运蛋白氨基酸序列在大豆中的同源蛋白序列各三个，同时获取其cds序列，并设计引物。
(2) 大豆总RNA提取
a.将大豆幼苗叶片剪碎后用研磨棒研磨，期间不断加入液氮，直至裂解液呈无明显碎片的粉末状；转入离心管后，加入1 mLTotal RNA提取试剂Trizol溶液室温静置5 min；
b.将静置5 min后的裂解液12000 g, 4℃离心5 min，小心吸取上清液，转移入新的离心管中；
c.向上清裂解液加入氯仿（为加入Trizol溶液的1/5体积量），盖紧离心管盖，振荡，待充分乳化溶液呈乳状（无分相现象）后，室温静置5 min；
d.12000 g, 4℃离心15 min；
e.吸取上清液转移至另一新的离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10 min；
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 目的基因克隆 2
1.2.2 重组质粒的构建 4
1.2.3 大豆目的基因在酵母中的功能验证 4
1.2.4 拟南芥的培育及目的基因在拟南芥中基因功能验证 4
1.2.5 在烟草中进行基因表达的亚细胞定位观察 5
2 结果与分析 5
2.1同源序列的查找 5
2.2基因克隆与载体构建 6
2.3酵母突变体回补实验 7
2.4拟南芥纯合体的筛选 10
3 讨论 12
3.1基因在酵母中的功能分析 12
3.2基因在拟南芥中的功能分析 13
致谢 13
参考文献 13
附录 14
大豆ABC（ATPBinding Cassette） 转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究
引言
ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒式转运蛋白(ATPbinding cassette transporters)，广泛存在于原核生物和真核生物中。在植物界，以大豆和拟南芥为代表的ABC转运蛋白家族多达120种以上。越来越多的证据表明真核细胞中ABC转运蛋白参与细胞膜脂质分子的转运[1]，目前对拟南芥及酵母中ABC转运蛋白家族及其作用机理研究基本透彻，而大豆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
中的ABC转运蛋白家族基因报道却比较少。
脂质的合成与分泌对生物的生存与理化反应有重要意义。首先，脂质的合成与生物体内的物质运输有关。如脂质合成与囊泡的合成及运输之间相互作用，能够提升生物体内的物质运输效率。同时，脂质可以保护生物、提高生物抗逆性。如植物叶片有角质层，主要成分为蜡质，可防止植物流失水分和抵抗微生物侵袭。对植物体内脂质的合成与分泌的研究具有非常重要的价值。
本研究拟在大豆中鉴定几个与脂质转运相关的ABC转运蛋白家族基因，以期为提高植物抗逆性和种子含油量奠定基础。此外，这方面的进一步研究将会对人类ABC转运蛋白的研究提供重要线索，并起到很大促进作用[2]。
目前已有证据表明酵母位于过氧化物酶体中的PXA1基因（基因座为YPL147w），PXA2基因[3]（基因座为YKL188c），位于质膜上的PDR5基因[4]（基因座为YOR153w），PDR11基因[5]（基因座为YIL013c）以及AUS1基因[6]（基因座为YOR011w）参与油脂形成与运输。
拟南芥中的ABC transporter基因对于酵母突变体恢复脂质代谢功能的重要作用：如克隆拟南芥中具有影响脂质分泌及代谢的ABC transporters家族中的一类基因CrMRP2，并转运入缺乏ScYCF1基因（影响酵母脂质代谢）的酵母突变体dty168Δ时，酵母突变体恢复了脂质代谢的活性[7]。
AtABCA9 transporter对于拟南芥的脂质合成及代谢的作用：在拟南芥的内质网上定位到了ABC transporter的家族基因AtABCA9，同时缺乏AtABCA9的拟南芥突变体种子的油脂含量下降达35%，该基因提供丰富的脂肪酸用于脂质代谢。[8]
种种证据表明研究ABC转运蛋白在脂质转运方面的功能是有实际意义并且完全可行的。
1 材料与方法
1.1 材料
本项目中所用的的酵母野生型为BY4741(MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体，BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体。野生型BY4742的突变体ybt1Δ由文献(Kailash Gulshan and W. Scott MoyeRowley.Vacuolar Import of Phosphatidylcholine Requires the ATPBinding Cassette Transporter Ybt1.2011.Trafic.12:12571268.)通讯作者Scott MoyeRowley实验室提供。BY4741野生型及突变体ybt1Δ和BY4742野生型由本院梁永恒教授实验室提供。
本项目中所用的拟南芥野生型为哥伦比亚0型，由本实验室自身提供。
1.2 方法
1.2.1 目的基因克隆
(1) 目的基因的选择
从Phytozome的数据库中通过blastp算法获得酵母Aus1、Ybt1、Pdr18三种ABC转运蛋白氨基酸序列在大豆中的同源蛋白序列各三个，同时获取其cds序列，并设计引物。
(2) 大豆总RNA提取
a.将大豆幼苗叶片剪碎后用研磨棒研磨，期间不断加入液氮，直至裂解液呈无明显碎片的粉末状；转入离心管后，加入1 mLTotal RNA提取试剂Trizol溶液室温静置5 min；
b.将静置5 min后的裂解液12000 g, 4℃离心5 min，小心吸取上清液，转移入新的离心管中；
c.向上清裂解液加入氯仿（为加入Trizol溶液的1/5体积量），盖紧离心管盖，振荡，待充分乳化溶液呈乳状（无分相现象）后，室温静置5 min；
d.12000 g, 4℃离心15 min；
e.吸取上清液转移至另一新的离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10 min；
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