高效产草酸菌株的筛选和鉴定
草酸可以保留住土壤中的钙，以达到减缓土壤pH下降的目的，有着巨大的土壤改良潜力。目前为止，草酸应用于土壤改良的研究还十分少见，利用微生物产草酸来固定土壤中的钙更是鲜有研究。本实验以筛选高效产草酸菌株为目标，筛选得到Y2和Y40两株细菌，在实验室培养条件下，两株菌能在40小时内将培养液中草酸浓度提高至850ppm左右。同时，实验用传统鉴定方法发现Y2菌株的菌落扁平湿润，呈黄褐色，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能在有氧条件下分解葡萄糖产酸，但不产生乙酰甲基甲醇，不能水解淀粉，能液化明胶，具有氧化酶和接触酶，对青霉素有抗性，能还原硝酸盐产生N2，不发酵葡萄糖和乳糖，能利用枸椽酸盐为唯一碳源，在42℃不能生长，根据这些特征将Y2确定为假单胞菌属；Y40菌株的菌落凸起不透明，呈白色，为革兰氏阴性球杆菌，无鞭毛，能在有氧条件下分解葡萄糖产酸，但不产生乙酰甲基甲醇，不能水解淀粉，也不能液化明胶，不具有氧化酶但存在接触酶，对青霉素有抗性，不能还原硝酸盐，不发酵葡萄糖和乳糖，能利用枸椽酸盐为唯一碳源，且能在42℃生长，根据这些特征将Y40确定为不动杆菌属，并用16SrDNA测序的方法证明了这一结果。实验为产草酸菌的应用奠定了基础，对传统手段鉴定细菌也有一定的借鉴意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 Y2和Y40细菌菌落形态观察2
1.3 Y2和Y40产草酸量的测定3
1.4 Y2和Y40生长曲线绘制3
1.5 Y2和Y40的革兰氏染色3
1.6鞭毛染色试验3
1.7 甲基红试验3
1.8 VP试验3
1.9 淀粉水解试验3
1.10 明胶液化试验4
1.11 接触酶试验4
1.12 氧化酶试验4
1.13 糖发酵试验4
1.14 青霉素抗性试验4
1.15 最高温度生长试验4
1.16 枸椽酸盐利用试验4
1.17 硝酸盐还原试验4
1.18 Y2和Y40细 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
菌总DNA提取5
1.19 Y2和Y40的16SrDNA扩增5
1.20 Y2和Y40的16SrDNA序列对比及进化树构建5
2 结果与分析5
2.1 Y2和Y40细菌菌落形态观察5
2.2 Y2和Y40产草酸量的测定5
2.3 Y2和Y40生长曲线绘制6
2.4 Y2和Y40的革兰氏染色7
2.5鞭毛染色试验8
2.6甲基红试验9
2.7 VP试验9
2.8淀粉水解试验9
2.9明胶液化试验10
2.10接触酶试验10
2.11氧化酶试验11
2.12糖发酵试验11
2.13青霉素抗性试验12
2.14最高温度生长试验13
2.15枸椽酸盐利用试验13
2.16硝酸盐还原试验14
2.17 Y2和Y40细菌总DNA提取14
2.18 Y2和Y40的16SrDNA扩增15
2.19 Y2和Y40的16SrDNA序列对比及进化树构建15
2.20 Y2和Y40的生理生化试验总结17
3 讨论 17
致谢18
参考文献19
附录 培养基及试剂配方20
高效产草酸菌株的筛选和鉴定
引言
在我国南部地区，降雨强烈，蒸发量远远低于降水量，土壤及其母质的淋溶作用相当强烈，因此土壤溶液中的盐基离子容易随水渗透向下移动，使土壤中易溶性成分减少。这时溶液中的H+取代土壤吸收性复合体上的金属离子，被土壤吸附，并随之出现交换性铝，形成酸性土壤。而近三十年来，为了获得高产，过度的化肥施用加剧了土壤的酸化，中国几乎所有土壤类型的pH值下降了0.13至0.80个单位，这种降幅在自然条件下往往需要数万年的时间[1]。
首先，土壤的酸化会严重影响土壤的质量，有研究表明，酸化会导致土壤交换性酸和铝的增加，这直接导致了酸化土壤对作物产生危害[2]。同时，土壤酸化会影响根系形成，酸化土壤中铝的毒害对根系的抑制作用最为明显，植物在铝胁迫的条件下，根尖和侧根会变短且硬化，根伸长也会受到抑制[3]。土壤酸化还会影响作物对大量元素和有益中量元素的吸收。研究表明，在酸化土壤中，存在硝酸还原酶的活性和合成被铝抑制的现象，从而干扰了作物根系对氮的吸收、同化和转移[4]。所有的影响几乎都会导致一个结果，作物产量的降低。研究表明，长期施用化学氮肥加剧红壤酸化，18年土壤pH 降低1.2~1.5个单位，导致作物产量随施肥年限呈降低趋势，其中小麦产量平均每年下降11~104 kghm2，玉米产量平均每年下降24~210 kghm2[5]。有盆栽试验研究表明，在浇灌水pH 为3.5~6内，随着pH 降低，水稻每穗粒数减少，结实率和产量降低。与杂交稻相比，常规稻对土壤酸化反应更为敏感，当土壤pH 降低时，产量下降也更为明显[6]。因此，如何防止土壤进一步酸化以及如何治理酸化土壤是现代中国农业面临的巨大挑战。
传统的酸性土壤改良方法一般是施用石灰，石灰能在中和土壤酸度的同时，提高土壤中钙元素的含量，从而改良酸性土壤，使作物增产。但此方法虽然效果明显，但需要一定的成本，而且需要每年施加，浪费人力的同时也带来了土壤板结等问题，不是从根本上解决土壤酸化的办法。相同原理的方法还有利用工业生产中产生的碱性废渣，这样也有一定的改良效果，并能在一定程度上减少成本。近些年来也有利用秸秆等农业废弃物来改良酸性土壤的方法，但改良效果并不是很稳定。时下研究最多的，则是利用生物质碳改良酸性土壤，但此方法还未得到推广。
研究表明，有效留住土壤中的盐基离子能有效防止土壤酸化，如Ca离子，而草酸与土壤中Ca离子形成草酸钙能有效保留住钙离子。
草酸（H2C2O4）和草酸盐是土壤中动植物、微生物的主要次级代谢产物之一[7]。草酸钙存在于215种裸子和被子植物中，并在超过1000种常见树木中被发现[8]，有些甚至超过了干重的百分之五十[9]。土壤中草酸的分泌对植物吸收磷和微量元素有着重大贡献。有研究表明，微生物氧化草酸钙能导致pH的上升[10]。
目前，草酸的生产工业上往往采用化学合成法，而对草酸的研究也因其对于人体有一定的毒副作用，都集中在草酸的降解。目前对于筛选产草酸菌的研究还处于一片空白，草酸也未曾应用于改良土壤酸化的研究。
本研究的目的为从土壤中筛选到高效产草酸菌株，对其进行了分类鉴定，以期在实际运用中该菌株施入土壤后产生的草酸能有效留住土壤钙离子，并减缓土壤酸化进程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
所筛得两株产草酸细菌Y2和Y40。
2 Y2和Y40细菌菌落形态观察
方法：将Y2和Y40两株菌，采用平板划线法，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃条件下，恒温培养24小时，并观察菌落形态（菌株生长状态）。
培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（配方见附录）。
1．3 Y2和Y40产草酸量的测定
方法：分光光度计法。
条件： V1100分光光度计，波长400nm。
步骤：标线绘制：以牛肉膏蛋白胨液体培养基为溶剂，溶解草酸，分别配置草酸浓度为0ppm、10ppm、100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm、600ppm、800ppm、1000ppm的标液，加入3%三氯化钛0.04ml/ml，混匀后立即在波长400nm处测其吸光度，将浓度作为横坐标，把吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 Y2和Y40细菌菌落形态观察2
1.3 Y2和Y40产草酸量的测定3
1.4 Y2和Y40生长曲线绘制3
1.5 Y2和Y40的革兰氏染色3
1.6鞭毛染色试验3
1.7 甲基红试验3
1.8 VP试验3
1.9 淀粉水解试验3
1.10 明胶液化试验4
1.11 接触酶试验4
1.12 氧化酶试验4
1.13 糖发酵试验4
1.14 青霉素抗性试验4
1.15 最高温度生长试验4
1.16 枸椽酸盐利用试验4
1.17 硝酸盐还原试验4
1.18 Y2和Y40细 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
菌总DNA提取5
1.19 Y2和Y40的16SrDNA扩增5
1.20 Y2和Y40的16SrDNA序列对比及进化树构建5
2 结果与分析5
2.1 Y2和Y40细菌菌落形态观察5
2.2 Y2和Y40产草酸量的测定5
2.3 Y2和Y40生长曲线绘制6
2.4 Y2和Y40的革兰氏染色7
2.5鞭毛染色试验8
2.6甲基红试验9
2.7 VP试验9
2.8淀粉水解试验9
2.9明胶液化试验10
2.10接触酶试验10
2.11氧化酶试验11
2.12糖发酵试验11
2.13青霉素抗性试验12
2.14最高温度生长试验13
2.15枸椽酸盐利用试验13
2.16硝酸盐还原试验14
2.17 Y2和Y40细菌总DNA提取14
2.18 Y2和Y40的16SrDNA扩增15
2.19 Y2和Y40的16SrDNA序列对比及进化树构建15
2.20 Y2和Y40的生理生化试验总结17
3 讨论 17
致谢18
参考文献19
附录 培养基及试剂配方20
高效产草酸菌株的筛选和鉴定
引言
在我国南部地区，降雨强烈，蒸发量远远低于降水量，土壤及其母质的淋溶作用相当强烈，因此土壤溶液中的盐基离子容易随水渗透向下移动，使土壤中易溶性成分减少。这时溶液中的H+取代土壤吸收性复合体上的金属离子，被土壤吸附，并随之出现交换性铝，形成酸性土壤。而近三十年来，为了获得高产，过度的化肥施用加剧了土壤的酸化，中国几乎所有土壤类型的pH值下降了0.13至0.80个单位，这种降幅在自然条件下往往需要数万年的时间[1]。
首先，土壤的酸化会严重影响土壤的质量，有研究表明，酸化会导致土壤交换性酸和铝的增加，这直接导致了酸化土壤对作物产生危害[2]。同时，土壤酸化会影响根系形成，酸化土壤中铝的毒害对根系的抑制作用最为明显，植物在铝胁迫的条件下，根尖和侧根会变短且硬化，根伸长也会受到抑制[3]。土壤酸化还会影响作物对大量元素和有益中量元素的吸收。研究表明，在酸化土壤中，存在硝酸还原酶的活性和合成被铝抑制的现象，从而干扰了作物根系对氮的吸收、同化和转移[4]。所有的影响几乎都会导致一个结果，作物产量的降低。研究表明，长期施用化学氮肥加剧红壤酸化，18年土壤pH 降低1.2~1.5个单位，导致作物产量随施肥年限呈降低趋势，其中小麦产量平均每年下降11~104 kghm2，玉米产量平均每年下降24~210 kghm2[5]。有盆栽试验研究表明，在浇灌水pH 为3.5~6内，随着pH 降低，水稻每穗粒数减少，结实率和产量降低。与杂交稻相比，常规稻对土壤酸化反应更为敏感，当土壤pH 降低时，产量下降也更为明显[6]。因此，如何防止土壤进一步酸化以及如何治理酸化土壤是现代中国农业面临的巨大挑战。
传统的酸性土壤改良方法一般是施用石灰，石灰能在中和土壤酸度的同时，提高土壤中钙元素的含量，从而改良酸性土壤，使作物增产。但此方法虽然效果明显，但需要一定的成本，而且需要每年施加，浪费人力的同时也带来了土壤板结等问题，不是从根本上解决土壤酸化的办法。相同原理的方法还有利用工业生产中产生的碱性废渣，这样也有一定的改良效果，并能在一定程度上减少成本。近些年来也有利用秸秆等农业废弃物来改良酸性土壤的方法，但改良效果并不是很稳定。时下研究最多的，则是利用生物质碳改良酸性土壤，但此方法还未得到推广。
研究表明，有效留住土壤中的盐基离子能有效防止土壤酸化，如Ca离子，而草酸与土壤中Ca离子形成草酸钙能有效保留住钙离子。
草酸（H2C2O4）和草酸盐是土壤中动植物、微生物的主要次级代谢产物之一[7]。草酸钙存在于215种裸子和被子植物中，并在超过1000种常见树木中被发现[8]，有些甚至超过了干重的百分之五十[9]。土壤中草酸的分泌对植物吸收磷和微量元素有着重大贡献。有研究表明，微生物氧化草酸钙能导致pH的上升[10]。
目前，草酸的生产工业上往往采用化学合成法，而对草酸的研究也因其对于人体有一定的毒副作用，都集中在草酸的降解。目前对于筛选产草酸菌的研究还处于一片空白，草酸也未曾应用于改良土壤酸化的研究。
本研究的目的为从土壤中筛选到高效产草酸菌株，对其进行了分类鉴定，以期在实际运用中该菌株施入土壤后产生的草酸能有效留住土壤钙离子，并减缓土壤酸化进程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
所筛得两株产草酸细菌Y2和Y40。
2 Y2和Y40细菌菌落形态观察
方法：将Y2和Y40两株菌，采用平板划线法，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃条件下，恒温培养24小时，并观察菌落形态（菌株生长状态）。
培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（配方见附录）。
1．3 Y2和Y40产草酸量的测定
方法：分光光度计法。
条件： V1100分光光度计，波长400nm。
步骤：标线绘制：以牛肉膏蛋白胨液体培养基为溶剂，溶解草酸，分别配置草酸浓度为0ppm、10ppm、100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm、600ppm、800ppm、1000ppm的标液，加入3%三氯化钛0.04ml/ml，混匀后立即在波长400nm处测其吸光度，将浓度作为横坐标，把吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线。
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