溧阳雁来菌菌种分子鉴定及培养条件优化
摘要：提取溧阳雁来菌菌种的DNA，扩增其ITS序列，测序后通过和GenBank中相似度较高的序列比对，构建系统发育树，经分析，鉴定出所采集到的子实体为雁来菌子实体。描述所采集子实体的形态特征，结合乳菇属中血红乳菇、窝柄黄乳菇子实体的形态特征，并与松乳菇子实体形态特征进行比对，进一步确定所采集子实体为松乳菇；优化雁来菌菌种的培养条件，利用PDA培养基与木屑培养基对比，并设置温度梯度，找到溧阳雁来菌的最适温度为24℃左右，并且木屑培养基相比较PDA培养基更适合雁来菌菌丝的生长。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 溧阳雁来菌分子鉴定2
1.1.1 材料 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 方法 2
1.2 溧阳雁来菌菌种培养基优化3
1.2.1 实验材料3
1.2.2 实验方法3
2 结果与分析3
2.1 分子鉴定结果3
2.2 培养基优化结果6
3 讨论6
致谢6
参考文献7
溧阳雁来菌菌种分子鉴定及培养条件优化
引言
雁来菌，学名松乳菇(Lactarius deliciosus)，又名三九菇、重阳菌。食用菌的一种，以寒露时松花落地所生为最佳，味鲜美，有异香。由于松乳菇是一种菌根菌，需要和松树柏树等形成菌根才能发育成子实体，并且松乳菇每年的出菇期很短，使得它的发生量在很大程度上受到限制，因此市场供应量一直很少，价格也从未出现过明显的下降。松乳菇不仅美味可口，具有很高的食用价值，同时还具有神奇的药用价值[13]。松乳菇现在还不能完全实现人工栽培，国内外利用菌根技术，在活的植物根部进行“菌根合成”[4]。陈昌元等[5]，翟耀华等[6]研究了松乳菇的人工栽培。国内已取得一定成功，人工栽培的松乳菇基地已获得了与天然松乳菇形态风味完全一样的子实体[7]。松乳菇与其他菇相似，菌种通常有母种、原种和栽培种。母种培养基用马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA）。常言道：“有收无收在于种，收多收少在于管
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
”，可见菌种在生产中的重要性。只有培养出好的松乳菇菌种，才能加快松乳菇的人工栽培研究。本论文实验通过木屑培养基与PDA培养基的对比，以及六个温度梯度的设置，对雁来菌菌种的生长条件进行优化。
1 材料与方法
1．1 溧阳雁来菌菌种分子鉴定实验
1．1．1 材料 经过菌种分离纯化后的雁来菌菌种原试管；液体PDA培养基
1．1．2 试剂
0.01 mol.L1Tris.HCl：三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液
2% CTAB：十六烷基三甲基溴化铵
0.02 mol.L1 EDTA：乙二胺四乙酸
1.4 mol.L1?NaCl、2%巯基乙醇、氯仿异戊醇混合液、无水乙醇、70%酒精
1．1．3 方法
1．1．3.1 菌丝体制作
将两支装有雁来菌菌种的试管接种至固体斜面培养基试管中，各扩五支试管，放入24℃恒温培养箱中，待其菌丝生长。五天后，选取未被污染的试管备用。制作液体PDA培养基，灭菌，冷却。将试管中的菌丝接种到五瓶液体PDA培养基中，放入24℃振荡培养箱中培养。五天后，将摇瓶取出，过滤得到菌丝体，装于五支微晶离心管中，备用。
1．1．3.2 DNA提取
取一支菌丝体离心管放入冰箱中冻结，然后置于研磨钵中研磨成浆，转入1.5 ml的离心管中，加入0.7 ml提取缓冲液（0.01 mol.L1?TrisHCl，pH 8.0；2% CTAB，w/v；0.02 mol.L1?EDTA；1.4 mol.L1?NaCl；2% 巯基乙醇，v/v），50℃水浴30 min，加入0.7 ml氯仿异戊醇混合液（24/1，v/v），振荡均匀形成乳浊液，5000 r.min1离心30 min，收集上清液，加入1 ml沉淀缓冲液（0.05 mol.L1?TrisHCl， pH 8.0；1% CTAB，w/v；0.01 mol.L1?EDTA）混合均匀，置室温沉淀30 min，然后在5000 r.min1离心15 min，收集沉淀，倒置离心管沥干。将沉淀物悬浮于0.5 ml 1 mol.L1?NaCl中，并加2倍体积冷冻无水乙醇，置冰箱中沉淀30 min。5000 r.min1离心15 min，收集沉淀，用1 ml 70%酒精洗涤并于5000 r.min1离心15 min，重复3次，制得DNA沉淀。
1．1．3.3 PCR扩增ITS区段
提取的DNA沉淀需经过PCR扩增，利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模版上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。
PCR扩增引物为上海生工公司合成的真菌通用引物ITS4和ITS5，PCR扩增试剂盒为上海生工试剂盒；
PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10μl
????? ?4种dNTP混合物 各200μmol/L
?????? 引物 各10~100pmol
?????? 模板DNA 0.1~2μg
?????? Taq DNA聚合酶 2.5μ
?????? Mg2+ 1.5mmol/L
?????? 加双或三蒸水至 100μl
PCR扩增程序：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1 min) ×30；72℃，5min。
将PCR扩增产物放入零下四度冰箱保存。
1．1．3.4 扩增产物测序、比对及系统发育树的构建
纯化后的PCR扩增产物由江苏康能生物工程股份有限公司测序；将测得的序列输入GenBank数据库，进行BLAST比对。下载相似度较高的代表性序列，用C1ustalx 2.0软件[8]进行多序列比对，同时以属外种AF325310(Russulu lepida)外类群，用Mega5.0软件包构建系统发育树，经bootstrap法1000次循环检验系统树的可靠性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 溧阳雁来菌分子鉴定2
1.1.1 材料 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 方法 2
1.2 溧阳雁来菌菌种培养基优化3
1.2.1 实验材料3
1.2.2 实验方法3
2 结果与分析3
2.1 分子鉴定结果3
2.2 培养基优化结果6
3 讨论6
致谢6
参考文献7
溧阳雁来菌菌种分子鉴定及培养条件优化
引言
雁来菌，学名松乳菇(Lactarius deliciosus)，又名三九菇、重阳菌。食用菌的一种，以寒露时松花落地所生为最佳，味鲜美，有异香。由于松乳菇是一种菌根菌，需要和松树柏树等形成菌根才能发育成子实体，并且松乳菇每年的出菇期很短，使得它的发生量在很大程度上受到限制，因此市场供应量一直很少，价格也从未出现过明显的下降。松乳菇不仅美味可口，具有很高的食用价值，同时还具有神奇的药用价值[13]。松乳菇现在还不能完全实现人工栽培，国内外利用菌根技术，在活的植物根部进行“菌根合成”[4]。陈昌元等[5]，翟耀华等[6]研究了松乳菇的人工栽培。国内已取得一定成功，人工栽培的松乳菇基地已获得了与天然松乳菇形态风味完全一样的子实体[7]。松乳菇与其他菇相似，菌种通常有母种、原种和栽培种。母种培养基用马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA）。常言道：“有收无收在于种，收多收少在于管
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
”，可见菌种在生产中的重要性。只有培养出好的松乳菇菌种，才能加快松乳菇的人工栽培研究。本论文实验通过木屑培养基与PDA培养基的对比，以及六个温度梯度的设置，对雁来菌菌种的生长条件进行优化。
1 材料与方法
1．1 溧阳雁来菌菌种分子鉴定实验
1．1．1 材料 经过菌种分离纯化后的雁来菌菌种原试管；液体PDA培养基
1．1．2 试剂
0.01 mol.L1Tris.HCl：三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液
2% CTAB：十六烷基三甲基溴化铵
0.02 mol.L1 EDTA：乙二胺四乙酸
1.4 mol.L1?NaCl、2%巯基乙醇、氯仿异戊醇混合液、无水乙醇、70%酒精
1．1．3 方法
1．1．3.1 菌丝体制作
将两支装有雁来菌菌种的试管接种至固体斜面培养基试管中，各扩五支试管，放入24℃恒温培养箱中，待其菌丝生长。五天后，选取未被污染的试管备用。制作液体PDA培养基，灭菌，冷却。将试管中的菌丝接种到五瓶液体PDA培养基中，放入24℃振荡培养箱中培养。五天后，将摇瓶取出，过滤得到菌丝体，装于五支微晶离心管中，备用。
1．1．3.2 DNA提取
取一支菌丝体离心管放入冰箱中冻结，然后置于研磨钵中研磨成浆，转入1.5 ml的离心管中，加入0.7 ml提取缓冲液（0.01 mol.L1?TrisHCl，pH 8.0；2% CTAB，w/v；0.02 mol.L1?EDTA；1.4 mol.L1?NaCl；2% 巯基乙醇，v/v），50℃水浴30 min，加入0.7 ml氯仿异戊醇混合液（24/1，v/v），振荡均匀形成乳浊液，5000 r.min1离心30 min，收集上清液，加入1 ml沉淀缓冲液（0.05 mol.L1?TrisHCl， pH 8.0；1% CTAB，w/v；0.01 mol.L1?EDTA）混合均匀，置室温沉淀30 min，然后在5000 r.min1离心15 min，收集沉淀，倒置离心管沥干。将沉淀物悬浮于0.5 ml 1 mol.L1?NaCl中，并加2倍体积冷冻无水乙醇，置冰箱中沉淀30 min。5000 r.min1离心15 min，收集沉淀，用1 ml 70%酒精洗涤并于5000 r.min1离心15 min，重复3次，制得DNA沉淀。
1．1．3.3 PCR扩增ITS区段
提取的DNA沉淀需经过PCR扩增，利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模版上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。
PCR扩增引物为上海生工公司合成的真菌通用引物ITS4和ITS5，PCR扩增试剂盒为上海生工试剂盒；
PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10μl
????? ?4种dNTP混合物 各200μmol/L
?????? 引物 各10~100pmol
?????? 模板DNA 0.1~2μg
?????? Taq DNA聚合酶 2.5μ
?????? Mg2+ 1.5mmol/L
?????? 加双或三蒸水至 100μl
PCR扩增程序：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1 min) ×30；72℃，5min。
将PCR扩增产物放入零下四度冰箱保存。
1．1．3.4 扩增产物测序、比对及系统发育树的构建
纯化后的PCR扩增产物由江苏康能生物工程股份有限公司测序；将测得的序列输入GenBank数据库，进行BLAST比对。下载相似度较高的代表性序列，用C1ustalx 2.0软件[8]进行多序列比对，同时以属外种AF325310(Russulu lepida)外类群，用Mega5.0软件包构建系统发育树，经bootstrap法1000次循环检验系统树的可靠性。
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