铅离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
摘要：目的：探究不同浓度的Pb2+对蚂蟥生长及其内在品质的影响。方法：通过静水停食实验法研究Pb2+对蚂蟥的急性毒性效应，得到Pb2+的安全浓度；采用生物量测定、3，5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯（ρ-NPP）比色法、福林-酚法等方法研究不同Pb2+浓度对蚂蟥的生长、消化酶活性、抗逆酶活性和内在品质的影响。结果表明：Pb2+的安全浓度为0.166 mg·L-1；Pb2+浓度范围在0.06~0.10 mg·L-1时，可以促进蚂蟥的生长；Pb2+对蚂蟥体内的消化酶活性具有不同程度的影响；一定浓度的Pb2+对抗逆酶活性存在抑制；不同Pb2+浓度处理的蚂蟥的抗凝血酶活性没有显著性差异，且达到药典标准。结论：0.06~0.10 mg·L-1是比较适宜蚂蟥生长的铅离子浓度范围。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试剂2
1.1.2 仪器2
1.1.3 实验动物2
1.2 方法2
1.2.1 试验设计2
1.2.2 酶液的制备2
1.2.3 特定生长率的测定2
1.2.4 消化酶活性的测定2
1.2.5 抗逆酶活性的测定3
1.2.6 蚂蟥内在品质的测定3
1.2.7 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 急性毒性实验结果3
2.1.1 中毒症状3
2.1.2 不同铅离子浓度对蚂蟥的急性毒性3
2.2 生长实验结果4
2.3 消化酶和抗逆酶实验结果4
2.3.1消化酶实验结果5
2.3.2 抗逆酶实验结果5
2.4 水蛭内在品质实验结果5
2.4.1 抗凝血酶实验结果5
2.4.2 重金属含量测定结果6
3 讨论6
3.1不同铅离子浓度对蚂蟥急性毒性的影响6
3.2 不同铅离子浓度对蚂蟥生长和消化酶活性的影响6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.3不同铅离子浓度对蚂蟥抗逆酶的影响 7
3.4不同铅离子浓度对蚂蟥内在品质的影响 7
致谢8
参考文献8
铅离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
引言
水蛭具有破血消症，逐瘀通经的功效，被普遍用在中医临床，市场前景十分广阔[12]。《中国药典》（2015年版）收载了蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)和柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)作为水蛭药材的动物基原[3]。目前市场上用量最大的是蚂蟥。
对蚂蟥的过度捕捞和生存环境的恶化，使得野生资源日益枯竭，供需矛盾日益突出，因此蚂蟥的人工养殖生产迫在眉睫。目前蚂蟥室外人工养殖技术取得了初步成功。由于水蛭的临床需求量在一直增加，我们更应重视其入药的安全性[4]。
重金属是环境中比较典型的污染物，动物摄入后经过食物链逐级传递并富集，在某些特定条件下有可能转变为毒性更高的有机化合物，最终威胁到人类的健康[5]。水生动物的生长发育及活动会受到重金属污染的影响。蚂蟥的生活特性和饲养方式，容易导致重金属积聚于体内[6]。铅是水生动物的非必需元素，水环境中的铅含量过高时，可能会造成水生动物中毒。近年来与蚂蟥相关的研究大多集中在药理、生理等[79]，重金属离子对蚂蟥生长及其内在品质的影响没有报道。本课题拟从铅离子对于蚂蟥的急性毒性效应入手，确定其对蚂蟥的半致死浓度及安全浓度，在此基础上研究不同浓度的铅离子对蚂蟥生长、消化酶、抗逆酶、抗凝血酶活性和铅离子在蚂蟥体内残留的影响，以期为重金属对蚂蟥室内养殖的意义提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂
硝酸铅Pb(NO3)2分析纯、DNS试剂、福林酚试剂、0.5 %干酪素、考马斯亮蓝G250、ρNPP溶液、对硝基酚溶液等。
1．1．2 仪器
电子天平（山海精密仪器厂）、5810R离心机（eppendorf）、FA1104分析天平（上海精科天平）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。
1．1．3 实验动物
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；梨形环棱螺Bellamya purificata Heude（采自南京前湖，野生）；曝气24 h的自来水。
1．2 方法
1．2．1 试验设计
1．2．1．1 急性毒性实验实验设计
实验容器为2 L塑料瓶，瓶中盛1 L铅离子溶液，实验蚂蟥体重3~5 g。以预实验为基础，设0.63、1.88、3.13、6.26、9.39 mgL1 5个质量浓度组，加1个空白组作为对照。实验持续4天。观察记录24、48、72、96小时的蚂蟥情况和一般现象。由蚂蟥死亡率数据，通过概率单位法得到Pb2+对蚂蟥48h、96h的半致死浓度值，进而得出安全浓度。
1．2．1．1 生长实验设计
在安全浓度下，设Pb2+为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mgL1 5个浓度梯度，另加1个空白对照组，每组蚂蟥30条。每天观察和记录蚂蟥的死亡量，每10天称1次重，实验时间持续60天。试验期间水温25±3 ℃。
1．2．2 酶液的制备
以喂养60天后的蚂蟥为试验材料，每个平行组随机取2条蚂蟥，将活蚂蟥固定于冰盘内进行解剖，取消化道，剔除其附着物，用预冷蒸馏水洗净，滤纸吸干表面水分，称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20 %的溶液，冷冻离心10 min(转速为1万rmin1)，取上清液为酶液，在4 ℃冰箱中保存，24 h内测定完成。
1．2．3 特定生长率的测定
特定生长率（SGR）=100×(lnWtlnW0)/t，式中W0为试验开始时蚂蟥的平均质量（g），Wt为结束时平均质量（g），t为实验天数（d）。
1．2．4 消化酶活性的测定
蛋白酶活性测定：采取福林酚法[10]，在37 ℃、一定的pH条件下，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。
淀粉酶活性测定：采取3，5二硝基水杨酸比色法[10]，在37 ℃条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成1 mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试剂2
1.1.2 仪器2
1.1.3 实验动物2
1.2 方法2
1.2.1 试验设计2
1.2.2 酶液的制备2
1.2.3 特定生长率的测定2
1.2.4 消化酶活性的测定2
1.2.5 抗逆酶活性的测定3
1.2.6 蚂蟥内在品质的测定3
1.2.7 数据分析3
2 结果与分析3
2.1 急性毒性实验结果3
2.1.1 中毒症状3
2.1.2 不同铅离子浓度对蚂蟥的急性毒性3
2.2 生长实验结果4
2.3 消化酶和抗逆酶实验结果4
2.3.1消化酶实验结果5
2.3.2 抗逆酶实验结果5
2.4 水蛭内在品质实验结果5
2.4.1 抗凝血酶实验结果5
2.4.2 重金属含量测定结果6
3 讨论6
3.1不同铅离子浓度对蚂蟥急性毒性的影响6
3.2 不同铅离子浓度对蚂蟥生长和消化酶活性的影响6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.3不同铅离子浓度对蚂蟥抗逆酶的影响 7
3.4不同铅离子浓度对蚂蟥内在品质的影响 7
致谢8
参考文献8
铅离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
引言
水蛭具有破血消症，逐瘀通经的功效，被普遍用在中医临床，市场前景十分广阔[12]。《中国药典》（2015年版）收载了蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)和柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)作为水蛭药材的动物基原[3]。目前市场上用量最大的是蚂蟥。
对蚂蟥的过度捕捞和生存环境的恶化，使得野生资源日益枯竭，供需矛盾日益突出，因此蚂蟥的人工养殖生产迫在眉睫。目前蚂蟥室外人工养殖技术取得了初步成功。由于水蛭的临床需求量在一直增加，我们更应重视其入药的安全性[4]。
重金属是环境中比较典型的污染物，动物摄入后经过食物链逐级传递并富集，在某些特定条件下有可能转变为毒性更高的有机化合物，最终威胁到人类的健康[5]。水生动物的生长发育及活动会受到重金属污染的影响。蚂蟥的生活特性和饲养方式，容易导致重金属积聚于体内[6]。铅是水生动物的非必需元素，水环境中的铅含量过高时，可能会造成水生动物中毒。近年来与蚂蟥相关的研究大多集中在药理、生理等[79]，重金属离子对蚂蟥生长及其内在品质的影响没有报道。本课题拟从铅离子对于蚂蟥的急性毒性效应入手，确定其对蚂蟥的半致死浓度及安全浓度，在此基础上研究不同浓度的铅离子对蚂蟥生长、消化酶、抗逆酶、抗凝血酶活性和铅离子在蚂蟥体内残留的影响，以期为重金属对蚂蟥室内养殖的意义提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂
硝酸铅Pb(NO3)2分析纯、DNS试剂、福林酚试剂、0.5 %干酪素、考马斯亮蓝G250、ρNPP溶液、对硝基酚溶液等。
1．1．2 仪器
电子天平（山海精密仪器厂）、5810R离心机（eppendorf）、FA1104分析天平（上海精科天平）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。
1．1．3 实验动物
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；梨形环棱螺Bellamya purificata Heude（采自南京前湖，野生）；曝气24 h的自来水。
1．2 方法
1．2．1 试验设计
1．2．1．1 急性毒性实验实验设计
实验容器为2 L塑料瓶，瓶中盛1 L铅离子溶液，实验蚂蟥体重3~5 g。以预实验为基础，设0.63、1.88、3.13、6.26、9.39 mgL1 5个质量浓度组，加1个空白组作为对照。实验持续4天。观察记录24、48、72、96小时的蚂蟥情况和一般现象。由蚂蟥死亡率数据，通过概率单位法得到Pb2+对蚂蟥48h、96h的半致死浓度值，进而得出安全浓度。
1．2．1．1 生长实验设计
在安全浓度下，设Pb2+为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mgL1 5个浓度梯度，另加1个空白对照组，每组蚂蟥30条。每天观察和记录蚂蟥的死亡量，每10天称1次重，实验时间持续60天。试验期间水温25±3 ℃。
1．2．2 酶液的制备
以喂养60天后的蚂蟥为试验材料，每个平行组随机取2条蚂蟥，将活蚂蟥固定于冰盘内进行解剖，取消化道，剔除其附着物，用预冷蒸馏水洗净，滤纸吸干表面水分，称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20 %的溶液，冷冻离心10 min(转速为1万rmin1)，取上清液为酶液，在4 ℃冰箱中保存，24 h内测定完成。
1．2．3 特定生长率的测定
特定生长率（SGR）=100×(lnWtlnW0)/t，式中W0为试验开始时蚂蟥的平均质量（g），Wt为结束时平均质量（g），t为实验天数（d）。
1．2．4 消化酶活性的测定
蛋白酶活性测定：采取福林酚法[10]，在37 ℃、一定的pH条件下，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。
淀粉酶活性测定：采取3，5二硝基水杨酸比色法[10]，在37 ℃条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成1 mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位。
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