甜叶菊内参基因的筛选
参考基因作为基因表达水平标准化分析的参照指标，被广泛用于基因表达地标准化分析中。持家基因常作为内参基因使用，而近来实验证明，常用的持家基因在不同环境条件下的表达水平存在差异，盲目使用持家基因作为内参基因会导致错误。本实验要找到一个或几个可用于甜叶菊转录水平分析的参考基因及其引物。利用基因全序列碱基变异情况扫描确定合适的引物并检测其可用性，借助荧光定量PCR和geNrom、NormFinder、BestKeeper三个程序的数据分析，从8个候选内参基因中筛选出了在不同样品中表达较为稳定的Unigene0012701基因，作为甜叶菊转录组数据分析用的内参基因。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 植物材料 2
1．2 总RNA的提取 2
1．3 cDNA的合成 2
1．4 候选内参基因的确定及引物设计 3
1．4．1 候选内参基因的确定 3
1．4．2 引物设计 3
1．4．3 引物筛选 3
1．5 荧光定量PCR 4
1．6 统计分析 4
2 结果与分析 4
2．1 引物特异性和扩增效率 4
2．2 内参基因的筛选 5
2．2．1 候选内参基因的Ct值分析 5
2．2．2 geNorm分析 6
2．2．3 NormFinder分析 7
2．2．4 BestKeeper分析 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
甜叶菊内参基因的筛选
中药学 叶杨潇
引言
转录组数据分析以能够稳定表达的基因作为重要的参考。特别是在定量PCR的研究中，为了尽可能去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上存在的差别来获得目标基因特异性表达的真正差异，一般选择一定的内参基因来进行校正和标准化。内参基因即内部参考基因，理想的内参基因需要有有适中的表达水平，并且在不同的组织、不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
同发育时期、不同的实验处理条件下没有明显的表达水平上的差异[1]，从而可以在检测基因表达水平的变化时作为标准参照物。其中，最为广泛使用的包括18s rRNA,GAPDH，EF1α（转录延伸因子），UBQ（泛素）和ACT（肌动蛋白）等内参基因；这些基因通常被称作持家基因，在细胞结构维护或者基础代谢中扮演着重要角色。近来，越来越多的实验表明，部分持家基因在受到多种实验条件处理的时候表达量会呈现一定的不稳定性[2]，影响其在基因表达研究中的应用。目前在没有更好的选择时，许多研究者选择忽视所分析的材料的生理发育状态，仍旧依赖其中的一两个基因进行实验。
早期关于内参基因的实验中，目标基因的表达水平分析往往依赖于某一个内参基因。然而现在研究表明，单内参基因并不是最佳选择，在qRTPCR实验里选择两个或两个以上的内参基因可获得更为可靠的结果[3]。为了从候选内参基因中筛选出最合适的内参基因，一些分析软件如geNorm[4],NormFinder[5]和BestKeeper[6]等被开发出来用于数据分析。这些软件大体相似，是基于Excel的加载宏，但他们的算法各不相同。例如，geNorm进行成对的比较，求出一系列实验样品和内参基因的几何平均数来筛选出最适用于给定样品的内参基因,即在各个样本中表达量差异较小的参考基因；geNorm不仅提供内参基因的稳定性排名，还指出了合适的内参基因数目。
甜叶菊Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl,菊科甜菊属的多年生草本植物，原产巴拉圭，叶片中已知含有三十多种甜菊糖苷的成分，包括高甜度低热量的RA（莱鲍迪甘A，Rebarudioside A)和STV（Steviolside),其甜度几乎是蔗糖的150~300倍[7]，是极好的天然甜味剂。本实验以甜叶菊转录组数据分析用内参基因的筛选为最终目的，从上海博豪生物测序的基因中筛选出8个较为合理的基因作为候选内参基因，利用qRTPCR对同一品种甜叶菊的四个不同部位不同生长时期的样品（分别为材料靠顶部的新叶、老叶，靠底部的老叶，茎秆）作表达量的分析，并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper3款不同的软件筛选出合适的内参基因用于甜叶菊的转录组数据分析。
1 材料与方法
1．1 植物材料
本实验所用植物材料均为大学罗庆云课题组所选育的甜叶菊。取同一株材料的上部老叶、嫩叶，下部老叶，茎秆四个部位进行实验。
1. 2 总RNA的提取
实验采用试剂盒法提取甜叶菊样品的总RNA，所用产品为生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒专门针对次生代谢物质如多酚、多糖在细胞裂解后与RNA紧密结合形成难溶物或沉淀的难题而研发，适用于各种植物样品的RNA快速提取，操作方便。实验所用的研钵、研杵、容量瓶均用锡纸包住后在烘箱180℃高温中烘烤8h；1.5mL离心管和枪头在0.1％的DEPC水中浸泡过夜，120℃高压灭菌30min方才使用。抽提方法如下：
1）取450μLBuffer RlysisPG加入至1.5ml的离心管中以备用。
2）取2025mg植物组织并且用液氮研磨成粉末，并加入到上述1.5mL离心管中，立即振荡混匀，室温放置5min。
3）12000rpm4℃离心3min,将上清液移至1.5mL离心管中。
4）加入1/2体积无水乙醇，充分混匀。
5）将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1min，室温1200rpm离心1min,倒掉收集管中废液。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 植物材料 2
1．2 总RNA的提取 2
1．3 cDNA的合成 2
1．4 候选内参基因的确定及引物设计 3
1．4．1 候选内参基因的确定 3
1．4．2 引物设计 3
1．4．3 引物筛选 3
1．5 荧光定量PCR 4
1．6 统计分析 4
2 结果与分析 4
2．1 引物特异性和扩增效率 4
2．2 内参基因的筛选 5
2．2．1 候选内参基因的Ct值分析 5
2．2．2 geNorm分析 6
2．2．3 NormFinder分析 7
2．2．4 BestKeeper分析 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
甜叶菊内参基因的筛选
中药学 叶杨潇
引言
转录组数据分析以能够稳定表达的基因作为重要的参考。特别是在定量PCR的研究中，为了尽可能去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上存在的差别来获得目标基因特异性表达的真正差异，一般选择一定的内参基因来进行校正和标准化。内参基因即内部参考基因，理想的内参基因需要有有适中的表达水平，并且在不同的组织、不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
同发育时期、不同的实验处理条件下没有明显的表达水平上的差异[1]，从而可以在检测基因表达水平的变化时作为标准参照物。其中，最为广泛使用的包括18s rRNA,GAPDH，EF1α（转录延伸因子），UBQ（泛素）和ACT（肌动蛋白）等内参基因；这些基因通常被称作持家基因，在细胞结构维护或者基础代谢中扮演着重要角色。近来，越来越多的实验表明，部分持家基因在受到多种实验条件处理的时候表达量会呈现一定的不稳定性[2]，影响其在基因表达研究中的应用。目前在没有更好的选择时，许多研究者选择忽视所分析的材料的生理发育状态，仍旧依赖其中的一两个基因进行实验。
早期关于内参基因的实验中，目标基因的表达水平分析往往依赖于某一个内参基因。然而现在研究表明，单内参基因并不是最佳选择，在qRTPCR实验里选择两个或两个以上的内参基因可获得更为可靠的结果[3]。为了从候选内参基因中筛选出最合适的内参基因，一些分析软件如geNorm[4],NormFinder[5]和BestKeeper[6]等被开发出来用于数据分析。这些软件大体相似，是基于Excel的加载宏，但他们的算法各不相同。例如，geNorm进行成对的比较，求出一系列实验样品和内参基因的几何平均数来筛选出最适用于给定样品的内参基因,即在各个样本中表达量差异较小的参考基因；geNorm不仅提供内参基因的稳定性排名，还指出了合适的内参基因数目。
甜叶菊Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl,菊科甜菊属的多年生草本植物，原产巴拉圭，叶片中已知含有三十多种甜菊糖苷的成分，包括高甜度低热量的RA（莱鲍迪甘A，Rebarudioside A)和STV（Steviolside),其甜度几乎是蔗糖的150~300倍[7]，是极好的天然甜味剂。本实验以甜叶菊转录组数据分析用内参基因的筛选为最终目的，从上海博豪生物测序的基因中筛选出8个较为合理的基因作为候选内参基因，利用qRTPCR对同一品种甜叶菊的四个不同部位不同生长时期的样品（分别为材料靠顶部的新叶、老叶，靠底部的老叶，茎秆）作表达量的分析，并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper3款不同的软件筛选出合适的内参基因用于甜叶菊的转录组数据分析。
1 材料与方法
1．1 植物材料
本实验所用植物材料均为大学罗庆云课题组所选育的甜叶菊。取同一株材料的上部老叶、嫩叶，下部老叶，茎秆四个部位进行实验。
1. 2 总RNA的提取
实验采用试剂盒法提取甜叶菊样品的总RNA，所用产品为生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒专门针对次生代谢物质如多酚、多糖在细胞裂解后与RNA紧密结合形成难溶物或沉淀的难题而研发，适用于各种植物样品的RNA快速提取，操作方便。实验所用的研钵、研杵、容量瓶均用锡纸包住后在烘箱180℃高温中烘烤8h；1.5mL离心管和枪头在0.1％的DEPC水中浸泡过夜，120℃高压灭菌30min方才使用。抽提方法如下：
1）取450μLBuffer RlysisPG加入至1.5ml的离心管中以备用。
2）取2025mg植物组织并且用液氮研磨成粉末，并加入到上述1.5mL离心管中，立即振荡混匀，室温放置5min。
3）12000rpm4℃离心3min,将上清液移至1.5mL离心管中。
4）加入1/2体积无水乙醇，充分混匀。
5）将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1min，室温1200rpm离心1min,倒掉收集管中废液。
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