三黄汤对幼龄蚂蟥生长及免疫的影响
目的探究三黄汤对幼龄蚂蟥消化道疾病预防作用的最适浓度。 方法采用观察不同浓度三黄汤(3.00‰、1.50‰、0.3‰、0.15‰、0.03‰)对消化道免疫低下的蚂蟥生长、存活情况，消化道组织形态结构的变化，以及蚂蟥生长，消化及非特异免疫基因表达量的变化，筛选预防蚂蟥消化道疾病的三黄汤浓度并阐明机制。 结果与其他组别相比，0.15‰的组效果最显著，存活率和特定生长率明显增高(p<0.05)。0.15‰的组蚂蟥消化道接近于正常蚂蟥消化道。实验组生长激素GH均明显高于对照组(p<0.05)，0.3‰的组消化酶基因表达量显著提高(p<0.05)。SOD、CAT、AKP基因表达量均比对照组高，0.15‰和0.3‰的组显著提高(p<0.05)。 结论0.15‰三黄汤能够恢复消化道免疫低下幼龄蚂蟥消化道组织结构，改善其非特异性免疫力并促进其生长。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1蚂蟥消化道免疫力低下模型的建立4
1.2.2不同浓度三黄汤对蚂蟥生长的影响4
1.2.3样品的石蜡切片制作4
1.2.4样品的生长激素基因表达量的测定 4
1.2.5样品的消化酶基因（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）表达量的测定4
1.2.6样品的非特异性免疫酶基因（SOD、CAT、AKP）表达量的测定 4
2 结果与分析5
2.1各浓度组的生长数据分析5
2.1.1各浓度组的存活率 5
2.1.2各浓度组平均增重率 5
2.1.3各浓度组特定生长率 5
2.2蚂蟥消化道结构变化分析 6
2.2.1食道的结构变化 6
2.2.2除第6侧盲囊外的嗉囊的结构变化 6
2.2.3第6对侧盲囊的结构变化 7
2.2.4肠部的结构变化 7
2.3 蚂蟥生长、消化酶及非特异性免疫酶基因表达量比较分析 8
2.3.1蚂蟥生长激素基因相对表达量 8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.3.2蚂蟥消化酶基因相对表达量 8
2.3.3蚂蟥非特异性免疫酶基因相对表达量 8
3讨论8
3.1三黄汤对蚂蟥特定生长率及存活率的影响8
3.2三黄汤对蚂蟥消化道结构变化的分析9
3.3三黄汤对蚂蟥消化酶基因表达量分析 9
3.4三黄汤对蚂蟥非特异性免疫酶基因表达量分析10
3.2小结与展望10
致谢 11
参考文献 12
三黄汤对幼龄蚂蟥生长及免疫的影响
引言
蚂蟥(Whitmania Pigra Whitman)，《中华人民共和国药典》[1]2015年版收载的三种水蛭之一，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲(Hirudinea)无吻蛭目黄蛭科[2](Haemo pidae)。水蛭为传统的活血化瘀药，具有破血消症、逐瘀通经的功效。目前国内外对蚂蟥药理作用、化学成分、临床作用等方面有一定的研究。
随着对水蛭的研究日渐深入，人工养殖已经取得阶段性成果，但依然面临着诸多难题亟待解决。环境的变化，尤其是温差的急剧变化，不仅会对机体的生理代谢以及免疫能力等方面造成显著影响，甚至威胁到养殖生物的生命。养殖生产的实践表明，大多数海水养殖生物在温度发生急剧变化时容易发生病害[3]。环境温度的变化影响了蚂蟥的生长和其自身的免疫功能，在养殖中发现，蚂蟥在低温环境下会因食欲不振导致肢体发白、萎软、懒于活动、肛门红肿等现象，造成大量死亡，严重影响了蚂蟥的生长和其自身的免疫功能，从而导致蚂蟥产量和经济效益的下降，如何防治蚂蟥消化道疾病已迫在眉睫。目前，中草药作为生长促进剂、免疫调节剂在养殖业中得到了广泛的应用。其中，三黄汤，亦是三黄泻心汤，张仲景的《金匮要略》中由大黄、黄连、黄芩组成[4]，本方为治疗热盛吐衄证要方，其药理[56]及临床[79]已有部分研究。其主要有效成分黄连碱在感染性疾病方面有很好的治疗作用，且可以调节免疫功能[10]；黄芩苷、黄芩素有很好的抗菌、抗氧化等作用[11]，大黄素对机体免疫功能有双向调节作用[12]。本实验将三黄汤运用到蚂蟥养殖过程中去，本实验探究三黄汤对蚂蟥消化道疾病预防作用的最适浓度，以及消化道结构变化和免疫酶基因的变化来阐明三黄汤的调节作用，为蚂蟥健康繁殖与疾病防治提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
成龄蚂蟥的经由大学中药研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)的卵茧。
三黄汤（大黄、黄连、黄芩水煎成每ml含1g生药）梯度乙醇，二甲苯，石蜡，苏木精，伊红，中性树胶，Trizol试剂，氯仿，异丙醇
FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司），切片机（RM2016型，德国Leica公司），LeicaHimO展片机，光学显微镜（BX51型日本Olympus公司），PCR分析仪，自动凝胶图像分析仪，电泳槽
1.2 方法
1.2.1 蚂蟥消化道免疫力低下模型的建立
将蚂蟥置于20°的光照培养箱中进行养殖，时间60天。
1.2.2 不同浓度三黄汤对蚂蟥生长的影响
模型造好后，试验用蚂蟥按质量、体积大小均匀分配到6个组中，分5个不同浓度三黄汤组别和1个模型组，分别标记为：对照组O，实验组A(3.00‰)，B(1.50‰)，C(0.3‰) ，D(0.15‰)，E(0.03‰)。平均每组15条左右，每条单独饲养于玻璃罐中，全部置于25℃下，共10d，期间以天然饵料螺蛳常规饲喂，每隔三天换一次水，加一次药，称重，记录死亡数。
采用存活率和特定生长率的计算方法（存活率( SR，%) = Nt /No ×100；特定生长率( SGR，% /d) = ( lnWt－lnWo) /t ×100）；对特定生长率进行方差分析。
1.2.3 样品的石蜡切片制作
采用石蜡切片的制作方法，取蚂蟥消化道组织固定于Bouin氏固定液中824h，70%乙醇过夜，95%各Ih,无水乙醇I、无水石醇II各45min脱水，使组织中的水分脱干净。然后入二甲苯I和二甲苯II各5min透明，接着再浸蜡和包埋，切片、二甲苯脱蜡、苏木精、伊红染色、中性树胶制片、镜检。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1蚂蟥消化道免疫力低下模型的建立4
1.2.2不同浓度三黄汤对蚂蟥生长的影响4
1.2.3样品的石蜡切片制作4
1.2.4样品的生长激素基因表达量的测定 4
1.2.5样品的消化酶基因（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）表达量的测定4
1.2.6样品的非特异性免疫酶基因（SOD、CAT、AKP）表达量的测定 4
2 结果与分析5
2.1各浓度组的生长数据分析5
2.1.1各浓度组的存活率 5
2.1.2各浓度组平均增重率 5
2.1.3各浓度组特定生长率 5
2.2蚂蟥消化道结构变化分析 6
2.2.1食道的结构变化 6
2.2.2除第6侧盲囊外的嗉囊的结构变化 6
2.2.3第6对侧盲囊的结构变化 7
2.2.4肠部的结构变化 7
2.3 蚂蟥生长、消化酶及非特异性免疫酶基因表达量比较分析 8
2.3.1蚂蟥生长激素基因相对表达量 8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.3.2蚂蟥消化酶基因相对表达量 8
2.3.3蚂蟥非特异性免疫酶基因相对表达量 8
3讨论8
3.1三黄汤对蚂蟥特定生长率及存活率的影响8
3.2三黄汤对蚂蟥消化道结构变化的分析9
3.3三黄汤对蚂蟥消化酶基因表达量分析 9
3.4三黄汤对蚂蟥非特异性免疫酶基因表达量分析10
3.2小结与展望10
致谢 11
参考文献 12
三黄汤对幼龄蚂蟥生长及免疫的影响
引言
蚂蟥(Whitmania Pigra Whitman)，《中华人民共和国药典》[1]2015年版收载的三种水蛭之一，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲(Hirudinea)无吻蛭目黄蛭科[2](Haemo pidae)。水蛭为传统的活血化瘀药，具有破血消症、逐瘀通经的功效。目前国内外对蚂蟥药理作用、化学成分、临床作用等方面有一定的研究。
随着对水蛭的研究日渐深入，人工养殖已经取得阶段性成果，但依然面临着诸多难题亟待解决。环境的变化，尤其是温差的急剧变化，不仅会对机体的生理代谢以及免疫能力等方面造成显著影响，甚至威胁到养殖生物的生命。养殖生产的实践表明，大多数海水养殖生物在温度发生急剧变化时容易发生病害[3]。环境温度的变化影响了蚂蟥的生长和其自身的免疫功能，在养殖中发现，蚂蟥在低温环境下会因食欲不振导致肢体发白、萎软、懒于活动、肛门红肿等现象，造成大量死亡，严重影响了蚂蟥的生长和其自身的免疫功能，从而导致蚂蟥产量和经济效益的下降，如何防治蚂蟥消化道疾病已迫在眉睫。目前，中草药作为生长促进剂、免疫调节剂在养殖业中得到了广泛的应用。其中，三黄汤，亦是三黄泻心汤，张仲景的《金匮要略》中由大黄、黄连、黄芩组成[4]，本方为治疗热盛吐衄证要方，其药理[56]及临床[79]已有部分研究。其主要有效成分黄连碱在感染性疾病方面有很好的治疗作用，且可以调节免疫功能[10]；黄芩苷、黄芩素有很好的抗菌、抗氧化等作用[11]，大黄素对机体免疫功能有双向调节作用[12]。本实验将三黄汤运用到蚂蟥养殖过程中去，本实验探究三黄汤对蚂蟥消化道疾病预防作用的最适浓度，以及消化道结构变化和免疫酶基因的变化来阐明三黄汤的调节作用，为蚂蟥健康繁殖与疾病防治提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
成龄蚂蟥的经由大学中药研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)的卵茧。
三黄汤（大黄、黄连、黄芩水煎成每ml含1g生药）梯度乙醇，二甲苯，石蜡，苏木精，伊红，中性树胶，Trizol试剂，氯仿，异丙醇
FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司），切片机（RM2016型，德国Leica公司），LeicaHimO展片机，光学显微镜（BX51型日本Olympus公司），PCR分析仪，自动凝胶图像分析仪，电泳槽
1.2 方法
1.2.1 蚂蟥消化道免疫力低下模型的建立
将蚂蟥置于20°的光照培养箱中进行养殖，时间60天。
1.2.2 不同浓度三黄汤对蚂蟥生长的影响
模型造好后，试验用蚂蟥按质量、体积大小均匀分配到6个组中，分5个不同浓度三黄汤组别和1个模型组，分别标记为：对照组O，实验组A(3.00‰)，B(1.50‰)，C(0.3‰) ，D(0.15‰)，E(0.03‰)。平均每组15条左右，每条单独饲养于玻璃罐中，全部置于25℃下，共10d，期间以天然饵料螺蛳常规饲喂，每隔三天换一次水，加一次药，称重，记录死亡数。
采用存活率和特定生长率的计算方法（存活率( SR，%) = Nt /No ×100；特定生长率( SGR，% /d) = ( lnWt－lnWo) /t ×100）；对特定生长率进行方差分析。
1.2.3 样品的石蜡切片制作
采用石蜡切片的制作方法，取蚂蟥消化道组织固定于Bouin氏固定液中824h，70%乙醇过夜，95%各Ih,无水乙醇I、无水石醇II各45min脱水，使组织中的水分脱干净。然后入二甲苯I和二甲苯II各5min透明，接着再浸蜡和包埋，切片、二甲苯脱蜡、苏木精、伊红染色、中性树胶制片、镜检。
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