蚂蟥hirudin基因克隆及吸食对其表达的研究
目的克隆蚂蟥水蛭素基因（Hirudin），研究吸食对蚂蟥Hirudin表达的影响。方法克隆水蛭素基因，通过RT-PCR进行定量分析。结果表明研究发现不同吸食时间水蛭素基因在体内表达量的整体变化趋势相同，都是先升高后下降，但各部位达到峰值的时间不同，唾液腺中第3天时水蛭素基因表达量最高，嗉囊和肠中的水蛭素基因分别在第5天和第7天达到峰值，变化趋势明显，差异显著。结论蚂蟥体内含有水蛭素基因（Hirudin），吸食行为和外源物质刺激会影响蚂蟥Hirudin的表达。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1.1动物 2
1.2菌株及载体 2
1.3仪器与试剂 2
2 方法 2
2.1 实验设计 2
2.2样品的采集与保存 2
2.3引物设计与合成 2
2.4RNA的提取与纯化 2
2.5RNA的鉴定 3
2.6去除基因组DNA和反转录反应 3
2.7Hirudin基因的cDNA克隆与测序 3
2.8生物信息学分析 3
2.9 Hirudin基因的时空表达分析 4
3 结果与分析 4
3.1蚂蟥水蛭素基因同源性分析及构建系统进化树 4
3.2蚂蟥水蛭素基因的生物信息学分析 5
3.3不同吸食阶段蚂蟥唾液腺中水蛭素基因相对表达量的变化 5
3.4不同吸食阶段蚂蟥嗉囊中水蛭素基因相对表达量的变化 6
3.5不同吸食阶段蚂蟥肠中水蛭素基因相对表达量的变化 6
讨论 7
致谢 7
参考文献 8
蚂蟥Hirudin基因克隆及吸食对其表达的研究
学生 蒋鹏
引言
引言
蚂蟥又叫宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）,隶属于环节动物门蛭纲无吻蛭目黄蛭科[2]，2015版《 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
中国药典》记载其属于水蛭科动物，干燥全体为中药材水蛭，药性咸、苦、平，有小毒，归肝经具有破血通经，活血化瘀的效果[67]。现代诸多的药理实验表明蚂蟥具有抗凝血、抗血栓、抗血小板聚集等药理活性，经常被用于治疗糖尿病、心脏病、肝硬化、高血压、哮喘病等疾病[1]。
水蛭素是一种单链多肽，由66个氨基酸残基组成，它的相对分子质量大约为 7 000。水蛭素同凝血酶的亲和能力相当强[3]，是目前所能鉴定出的最强的凝血酶特异性抑制剂[4]。水蛭素能够降低蛋白尿,改善肾功能,降低血脂,具有抗凝抗血栓成、改变血液流变性、抗炎、抗增殖和抗纤维化等多种药理活性[28]，对治疗心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景[2627]。水蛭素中还含有抗炎酶，是其产生抗炎作用的主要原因。
节肢动物虽小,但吸食过程同样要在中枢神经系统统一支配下经内外感受器和神经
反馈环的共同调节来完成，蚂蟥吸食过程经由唾液腺到嗉囊，再到肠，研究发现水蛭素大多在于水蛭的新鲜唾液腺中，而且含量甚微，因此水蛭素的基因重组技术的研究也取得了一定进展[5]，但效果尚不理想。目前为止，鲜见蚂蟥以及其他非吸血蛭水蛭素基因的研究报道，本实验拟通过克隆蚂蟥水蛭素基因（Hirudin），同时研究吸食对水蛭素基因表达的影响，为蚂蟥水蛭素基因的研究提供参考资料。
1 材料
1.1动物
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；螺蛳（采自南京前湖，野生）经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude，在投喂过程中，取吸食后停止投喂的第1，3，5，7，11天的9条蚂蟥的唾液腺，嗉囊和肠80℃保存备用，用于抗凝基因时空表达研究。
1.2菌株及载体
大肠杆菌感受态、pMD18T载体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
1.3仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）,电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）。Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green mixture、PrimeScript TR Master Mix、TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 标准品( DL2000) 均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
2 方法
2.1 实验设计
选取60只生长状况良好的蚂蟥，用2L罐子分罐装，每罐一只，注入1.2L曝气过后的水，期间以天然饵料螺蛳（采集于南京前湖，野生，经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺B.purificata）常规饲喂，喂养60d,在投喂过程中，分别记录其吸食日期。
2.2样品的采集与保存
取吸食后停止投喂的第1，3，5，7，11天的9条蚂蟥，冰盘解剖，分别取蚂蟥的唾液腺，嗉囊和肠80℃保存备用，用于抗凝基因时空表达研究。
2.3引物设计与合成
利用Primer 5.0以拼接的EST序列作为引物设计的靶序列,分别设计蚂蟥的hirudin基因以及guamerin基因的克隆和定量PCR的引物（见表1）。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1.1动物 2
1.2菌株及载体 2
1.3仪器与试剂 2
2 方法 2
2.1 实验设计 2
2.2样品的采集与保存 2
2.3引物设计与合成 2
2.4RNA的提取与纯化 2
2.5RNA的鉴定 3
2.6去除基因组DNA和反转录反应 3
2.7Hirudin基因的cDNA克隆与测序 3
2.8生物信息学分析 3
2.9 Hirudin基因的时空表达分析 4
3 结果与分析 4
3.1蚂蟥水蛭素基因同源性分析及构建系统进化树 4
3.2蚂蟥水蛭素基因的生物信息学分析 5
3.3不同吸食阶段蚂蟥唾液腺中水蛭素基因相对表达量的变化 5
3.4不同吸食阶段蚂蟥嗉囊中水蛭素基因相对表达量的变化 6
3.5不同吸食阶段蚂蟥肠中水蛭素基因相对表达量的变化 6
讨论 7
致谢 7
参考文献 8
蚂蟥Hirudin基因克隆及吸食对其表达的研究
学生 蒋鹏
引言
引言
蚂蟥又叫宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）,隶属于环节动物门蛭纲无吻蛭目黄蛭科[2]，2015版《 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
中国药典》记载其属于水蛭科动物，干燥全体为中药材水蛭，药性咸、苦、平，有小毒，归肝经具有破血通经，活血化瘀的效果[67]。现代诸多的药理实验表明蚂蟥具有抗凝血、抗血栓、抗血小板聚集等药理活性，经常被用于治疗糖尿病、心脏病、肝硬化、高血压、哮喘病等疾病[1]。
水蛭素是一种单链多肽，由66个氨基酸残基组成，它的相对分子质量大约为 7 000。水蛭素同凝血酶的亲和能力相当强[3]，是目前所能鉴定出的最强的凝血酶特异性抑制剂[4]。水蛭素能够降低蛋白尿,改善肾功能,降低血脂,具有抗凝抗血栓成、改变血液流变性、抗炎、抗增殖和抗纤维化等多种药理活性[28]，对治疗心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景[2627]。水蛭素中还含有抗炎酶，是其产生抗炎作用的主要原因。
节肢动物虽小,但吸食过程同样要在中枢神经系统统一支配下经内外感受器和神经
反馈环的共同调节来完成，蚂蟥吸食过程经由唾液腺到嗉囊，再到肠，研究发现水蛭素大多在于水蛭的新鲜唾液腺中，而且含量甚微，因此水蛭素的基因重组技术的研究也取得了一定进展[5]，但效果尚不理想。目前为止，鲜见蚂蟥以及其他非吸血蛭水蛭素基因的研究报道，本实验拟通过克隆蚂蟥水蛭素基因（Hirudin），同时研究吸食对水蛭素基因表达的影响，为蚂蟥水蛭素基因的研究提供参考资料。
1 材料
1.1动物
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；螺蛳（采自南京前湖，野生）经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude，在投喂过程中，取吸食后停止投喂的第1，3，5，7，11天的9条蚂蟥的唾液腺，嗉囊和肠80℃保存备用，用于抗凝基因时空表达研究。
1.2菌株及载体
大肠杆菌感受态、pMD18T载体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
1.3仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）,电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）。Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green mixture、PrimeScript TR Master Mix、TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 标准品( DL2000) 均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
2 方法
2.1 实验设计
选取60只生长状况良好的蚂蟥，用2L罐子分罐装，每罐一只，注入1.2L曝气过后的水，期间以天然饵料螺蛳（采集于南京前湖，野生，经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺B.purificata）常规饲喂，喂养60d,在投喂过程中，分别记录其吸食日期。
2.2样品的采集与保存
取吸食后停止投喂的第1，3，5，7，11天的9条蚂蟥，冰盘解剖，分别取蚂蟥的唾液腺，嗉囊和肠80℃保存备用，用于抗凝基因时空表达研究。
2.3引物设计与合成
利用Primer 5.0以拼接的EST序列作为引物设计的靶序列,分别设计蚂蟥的hirudin基因以及guamerin基因的克隆和定量PCR的引物（见表1）。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zyx/214.html
