茶树原生质体的初步培养(附件)
目录
摘要 1
关键词 1
引言 1
1材料与方法 1
1.1材料 1
1.1.1 材料的获得 1
1.1.2 材料的处理 1
1.2方法 1
1.2.1 原生质体分离、活化及活性测定 1
1.2.2原生质体培养 2
2结果与分析 2
2.1适宜材料的选择 2
2.2以胚为实验材料时酶液中酶的浓度和酶解时间的确定 2
2.2.1不同酶浓度对原生质体分离的影响 2
2.2.2不同酶解时间原生质体分离的影响 2
2.3液体培养基悬浮培养茶树原生质体 3
3 讨论 5
致谢 5
参考文献 5
ABSTRACT 6
KEY WORDS 6
图1 2
图2 2
图3 3
图4 3
图5 3
图6 3
图7 3
图8 4
图9 4
图10 4
表1 2
茶树原生质体的初步培养
学生 谢雪阳
[摘要]：以茶树幼嫩叶片和胚作为分离原生质体的起始材料，筛选出胚作为原生质体制备材料。探究了酶解液的组成、酶液的PH、酶解时间对茶树原生质体制备的影响。通过条件验证试验确定了茶树原生质体分离的最佳条件。适合胚酶解的酶液组成为纤维素酶 R10 2 % + 果胶酶Y23 0.5 %+牛血清蛋白0.1 %+MES 0.1 %+PVP 1.0 %+甘露醇0.5 molL1，CPW溶液溶解,pH 5.8，置于摇床30 rmin1，25 ℃黑暗条件下酶解24 h；以 B5培养基（不含琼脂、蔗糖、激素）+蔗糖0.05 %+甘露醇0.5 molL1+2,4D 0.2 mgL1+6BA 1.0 mgL1对原生质体进行培养，黑暗,温度27±0.5 ℃,对
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原生质体进行悬浮培养，结果表明B5液体培养基基本能够满足茶树原生质体的生长。
[关键词]：茶树；胚；幼嫩叶片；原生质体制备；原生质体初步培养
引言 茶树(Camellia sinensis )属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶叶是我国重要的传统经济作物，它在农村山区建设与发展中起到十分重要的作用，其遗传改良具有十分重要的意义[1]。我国的茶园面积和茶叶产量世界第一，但与先进产茶国相比，我国茶园单产和茶树良种普及率较低，因此摆在茶树育种工作者面前的任务是非常艰巨的。目前用于茶树育种的现代生物技术大体上有组织和器官培养技术、花粉（药）培养和单倍体培育技术、原生质体培养和体细胞杂交技术等。其中原生质体技术可以为茶树育种基础研究和遗传工程提供一个良好的遗传操作系统 [2]。
原生质体是指通过机械或酶解等特殊方法脱去细胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被细胞膜所包围的原生质团。原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源DNA、染色体、细胞器、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径，原生质体培养在植物快速繁殖、植物远缘遗传重组、转基因以及品种改良和创造新类型等方面具有广阔的应用前景[3]。试验以茶树为材料，从原生质体分离、纯化、培养方式方面入手，对比分析不同分离方法和培养方式，探究影响茶树原生质体培养的主要因素，希望能为植株再生和品种改良提供途径。
1 材料与方法
1.1 材料
茶树幼嫩叶片、茶籽由大学茶学实验室提供，品种为迎霜。
1.1.1材料的获得：411月，取茶树第13片展开叶。12月4月，将茶籽用水浸泡，待其子叶胀大，深褐色外壳破裂，明显露出白色胚后，取出备用。
1.1.2材料处理：取茶树第13片展开叶，去主叶脉，称取1 g，（或取胚1 g）,用酒精棉球擦拭一遍，至于直径为6 cm的平底培养皿中。转至超净工作台中,依次用75%酒精表面消毒 1015 s，1 %次氯酸钠（NaClO）灭菌10 min[4]。用蒸馏水将材料冲洗56次，再切成2 mm宽的细条，剁碎。
1.2 方法
1.2.1原生质体分离、活化及活性测定：茶树幼嫩叶片及胚均进行原生质体的分离培养。酶液以0.5 mol/L 的甘露醇作为渗透压调节剂[5]，用CWP[6]溶液进行配置，配置酶液10 mL，酶液组成为纤维素酶 R10 2 % +果胶酶Y23 0.5 %+牛血清蛋白0.1 % +MES 0.1 % ，PVP 1.0 % 。先将酶液置于55 ℃的水浴锅内加热10 min激活，冷却至室温备用，酶液为棕色透明状。
纤维素酶 R10、果胶酶Y23、牛血清蛋白、MES、PVP均为Solarbio公司生产，纤维素酶 R10活性≥10.0 U/mg，果胶酶Y23活性≥1.0 U/mg。CPW溶液(cell protoplast wash medium)，细胞—原生质体清洗液,组成为KH2PO4 27.2 mgL1 +KNO3 101.0 mgL1 +CaCl22H2O 1480.0 mgL1 + MgSO47H2O 246.0 mgL1 KI 0.16 mgL1 + CuSO45H2O 0.025 mgL1 [2]，pH 5.8[3]。
将上述材料置于摇床，以30 rmin1,25 ℃黑暗条件下酶解16 h,20 h和24 h。酶解结束后，将酶解液先后用100目和300目细胞筛过滤，除去未酶解的材料及大细胞团，然后将滤液转至10 ml 的离心管中离心 6 min，转速 800 rmin1。弃去上清液后，将原生质体以CPW+13 %甘露醇多次洗涤，并 800 rmin1，时间6 min[3]离心，弃去上清液后用原生质体液体培养液洗涤，组成为B5培养基（不含琼脂、蔗糖、激素）+蔗糖0.05 %+甘露醇0.5 molL1+2,4D 0.2 mgL1+6BA 1.0 mgL1。
茶树原生质体的活力测定通过FDA法[7]来完成。FDA是荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate,FDA）,用丙酮配制成2 mgmL1溶液在冰箱(4℃)中保存，取洗涤过的原生质体悬浮液0.5 mL,置于10 mm ×100 mm 的小试管中，加入FDA溶液使其最终体积浓度为 0.01 %，混匀，置于室温5 min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶绿素本身能产生荧光，叶肉原生质体发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的[18]。
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