全卵巢冷冻和移植技术综述

摘要：生育期女性癌症患者的生存率升高,对儿童及年轻女性患者的生育力保存需在肿瘤治疗前有所策略.卵巢组织冷冻具有一次性保存大量卵子的优势,其中完整卵巢冷冻复苏后移植具有即刻恢复血供,减少缺血损伤,并且能保存大量卵泡的优势.然而全卵巢冷冻技术仍然为实验性技术,临床应用仍有许多困难,本文将从全卵巢冷冻技术 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com 
.复苏后移植.存在的问题及展望做一综述.关键字：完整卵巢;冷冻;生育力保存;卵巢组织的冷冻保存主要包括卵巢皮质冷冻和整个卵巢冷冻.卵巢皮质移植后血供的恢复需要待新生血管形成,而在此过程中会引起卵巢组织的缺血损伤[1],以及较多卵泡的损失[2,3],以至影响移植物寿命.完整卵巢冷冻移植可即刻恢复移植物血供,最大程度地减少移植物缺血损伤,理论上可克服这个难题,且整个卵巢较皮质块含有更多的原始卵泡,有望长期保持卵巢功能.2002年Wang等[4]第一次报道了鼠完整卵巢冻融后行血管吻合移植,后续研究对羊及小鼠行全卵巢冷冻后移植,均成功获得妊娠[5,6],显示完整卵巢通过血管吻合移植具有可行性,并且卵巢功能可恢复.Silber等[7]通过血管吻合移植技术实现了人完整卵巢移植,移植术后受者女性妊娠并且活产一名女婴.因此,从技术上来说,大型哺乳动物冷冻后行血管吻合-卵巢移植是可行的.但是,目前数据显示,冻融后完整卵巢移植的成功率仍然非常低[8].可见,完整卵巢冷冻仍存在许多难题.因此,在这项技术应用于临床之前,仍需进行大量实验研究探索最有效的方案.1.完整卵巢冷冻方案的选择完整卵巢冷冻所采用的冷冻保护剂与卵巢皮质冷冻相似,包括渗透性冷冻保护剂,如二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO).乙二醇(ethyleneglycol,EG)和丙二醇(propyleneglycol,PROH)等,及非渗透性冷冻保护剂,如糖类.动物血清等.相较于卵巢皮质,整个卵巢器官的细胞成分更复杂,而冷冻保护剂对各种类型组织细胞的最佳渗透性及低毒性也并非一致[9],因此冷冻保护剂的选择至关重要.DMSO对卵巢皮质内卵泡密度和正常组织形态的保护作用确定[10],但对卵巢皮质下及髓质组织保护欠充分.Westphal等研究显示,通过将卵巢浸泡在10%DMSO15min即可充分保护卵巢皮质层,DMSO联合乙二醇灌注卵巢60min可使卵巢皮质下及髓质层得到较好的保护作用,对卵巢三个组织层的保护作用达90%以上,并且对内皮细胞亦无明显毒性作用[11].同时为使冷冻保护剂浸入卵巢组织的核心部分,合适的灌注压力及时长也是重要的环节.灌注时长不足.压力过小不能使组织得到充分灌注,从而引起细胞内外冰晶形成而损伤细胞；而灌注时长过长.压力过大则可能引起血管破裂,也会使细胞遭受更重的化学毒性,使冷冻效果变差[12,13].目前应用于完整卵巢冷冻的方法主要包括慢速冷冻.快速冷冻及玻璃化冷冻.慢速冷冻包括程序化冷冻及定向冷冻.程序化冷冻,即应用程序化降温仪,使卵巢按预先设定的程序降温冷冻,投入液氮保存.首例完整羊卵巢冷冻移植即采用了程序化冷冻方法,复苏后完整卵巢冻存组的卵泡活力及凋亡细胞检测与卵巢皮质组冻存组无明显差异,经血管吻合自体移植术后,血清FSH较术前无明显差异,且短期内效果较好[14].Imhof等长期随访冻融移植后的羊的完整卵巢,发现移植后羊血清FSH可恢复正常,部分(4/9只)羊恢复排卵功能,移植18~19月后,卵巢基质保持完整(6/9只),其中1只在移植术后545天分娩1只小羊[6].定向冷冻(directionalfreezing)是多元热梯度仪(Multi-thermal-Gradient)实现的冷冻方法,装有卵巢及冷冻保护剂的冻存管按一定速度(V)通过不同温度梯度(G)的模块,通过改变冻存管经过不同温度模块的速度即可调节降温速率(B),即B=G×V.该方法理论上可快速移除结晶过程中释放出的热来保持整个器官恒定的降温速率降温,因此保存对冷冻损伤敏感的基质细胞及血管完整性等方面有优势.近期有学者比较了定向冷冻和传统程序化冷冻,认为定向冷冻组对维持卵巢组织正常卵泡形态[(89±1.7)%vs(61±3.4)%].基质细胞(17041个/mm2vs10875个/mm2)及血管完整性等优于传统程序化冷冻组；且卵巢组织经培养后,能恢复功能的原始卵泡数.发育能力及增殖能力在定向冷冻组中较好,且DNA损伤较少,修复增加[15].快速冷冻是指经过灌注平衡液及冷冻保护剂的卵巢直接投入液氮中,Xu等[16]尝试将其应用于完整卵巢冻存,但在保持卵泡组形态不如慢速冷冻有优势,细胞的损伤及凋亡增加.可能由于过快的降温速率使细胞内水分无法达到平衡状态,形成冰晶从而导致组织的损伤.玻璃化冷冻通过冷冻保护剂置换细胞中的水分,随后直接投入液氮中固化,其广泛用于卵子.胚胎及卵巢皮质的冷冻保存,因其应用更高浓度的冷冻保护剂,理论上可阻止冰晶的形成以防止卵巢内结构的破解,提高降温速率,因此应用于全卵巢冷冻也有其吸引力.有学者对比了不通冷冻方法保存完整卵巢的效果,通过比较卵泡活力.正常始基卵泡比例.培养后激素水平等方面认为玻璃化冷冻较慢速冷冻有优势[8,17].提示玻璃化冷冻或许适合完整卵巢的冻存.但高浓度玻璃化冷冻液,较难充分弥散入整个卵巢组织,潜在化学毒性大,易引起组织渗透性休克.因此,仍需进一步研究探索适合的冷冻液浓度.2.人完整卵巢冷冻研究现状虽然在动物模型上,全卵巢冷冻取得了长足进展,但人卵巢体积较大,在冻融过程中人卵巢组织中热质传递的问题更加明显.正常人卵巢标本难以获取,且存在伦理问题,目前大多数用于人卵巢冷冻试验的标本来自绝经前行子宫双附件切除的女性.尽管人全卵巢冷冻存在技术上的难题,但仍有一些初步进展.2004年,Martinez-Madrid等[18]首次报道了应用程序化冷冻的方法冻存人完整卵巢,其研究结果显示冻融组卵泡成活率75.1%,未发现严重受损卵泡.透射电镜亦显示,冻融卵巢超微结构保存较好,初级卵泡.始基卵泡及内皮细胞外观正常[19].Bedaiwy等[20]对人的完整卵巢和卵巢皮质冷冻效果进行了比较,发现冻融后完整卵巢的始基卵泡数.凋亡坏死情况与卵巢皮质相似.前述的Westphal等[11]探索优化冷冻方案应用于人卵巢冷冻,均见整个卵巢表层及深层组织均能被较好的保存.3.冻融后完整卵巢移植完整卵巢较卵巢皮质移植的优势在于其可通过血管吻合移植到受体,从而缩短缺血时间,减少卵泡损失,理论上可延长移植物寿命.移植方式包括自体移植和异体移植.自体移植因无需使用免疫抑制剂,且不涉及伦理问题而成为理想选择.受体的多处血管可用于同移植物卵巢血管吻合.根据移植部位的不同,可分为原位移植和异位移植.对于任何移植部位,均需考虑如自然受孕的机会.手术的可行性以及移植后是否容易获取卵母细胞的临床问题.其中原位自体移植因其将来可获得自然妊娠而备受青睐,在动物模型上已有多例冻融后完整卵巢移植的实验获得成功,14只母羊中4至获得妊娠并活产7只小羊[21].但考虑到肿瘤患者仍有卵巢转移的风险,原位移植后监测卵巢组织中的恶性细胞非常困难,且原位移植需进行全身麻醉及腹部手术.因此有学者认为,原位移植并不是最优选,为了降低手术风险,并且能从移植物中监测和频繁取卵,异位移植更优于原位移植,并且异位自体移植后可借助辅助生殖技术获得妊娠.但最适合的异位移植部位尚不清楚,Fathi等在大鼠模型中的研究显示,颈部皮下位点可较好地保留卵泡,并且更易监测和取出卵母细胞,是异位移植的一个较好的位置选择[22].4问题及展望完整卵巢冷冻及移植尽管已获得令人鼓舞的成绩,但该技术仍然存在一些问题：冷冻保护剂不能充分平衡弥散到各种组织中[23]；降温过程中卵巢核心与外周部位会出现热传递及冷冻速率不同步[24]；灌洗.预平衡.灌注冷冻保护剂过程中不可避免地对血管内皮造成影响[25],无论冷冻过程或移植后形成血栓,均会造成卵泡的损失,从而减少了完整卵巢冻存移植带来的可能获益.此外,移植后卵巢的存活卵泡数也受血管吻合手术熟练度及手术时间影响,对术者的要求较高[26].需关注的一点是,对肿瘤患者,卵巢组织中有潜在携带癌细胞的风险,可能导致肿瘤细胞的再种植[27].因此,完整卵巢移植的安全性需要术前评估,对白血病.淋巴瘤等偏好向卵巢转移的肿瘤,需适当限制患者行卵巢移植以降低这种可能性[28].尽管完整卵巢冷冻移植面临着众多困难和挑战,至今尚无人类完整卵巢冷冻移植的报道,但该技术将来有可能成为癌症患者及卵巢早衰患者生育力保存的选择.因此探索完整卵巢冷冻的最佳冷冻方案及改进发展卵巢冷冻设备仍是未来此领域的研究方向.参考文献[1]LeeJ,KongHS,KimEJ,etal.Ovarianinjuryduringcryopreservationandtransplantationinmice:acomparativestudybetweencryoinjuryandischemicinjury[J].HumReprod,2016,31(8):1827-1837[2]DemeestereI.Orthotopicandheterotopicovariantissuetransplantation[J].BestPractResClinObstetGynaecol,2009,15(6):649-665[3]CelikS,CelikkanFT,OzkavukcuS,etal.Expressionofinhibitorproteinsthatcontrolprimordialfolliclereservedecreasesincryopreservedovariesafterautotransplantation[J].JAssistedReprodGenet,2018,35(4):615-626[4]WangX,ChenH,YinH,etal.Fertilityafterintactovarytransplantation[J].Nature,2002,415(6870):385[5]DingY,ShaoJL,LiJW,etal.Successfulfertilityfollowingoptimizedperfusionandcryopreservationof2wholeovaryandallotransplantationinaprematureovarianinsufficiencyratmodel[J].JOvarianRes,2018,11(1):35[6]ImhofM,BergmeisterH,LipovacM,etalOrthotopicmicrovascularreanastomosisofwholecryopreservedovineovariesresultinginpregnancyandlivebirth[J].FertilSteril,2006,85:1208-1215[7]SilberSJ,GrudzinskasG,GosdenRG.Successfulpregnancyaftermicrosurgicaltransplantationofanintactovary[J].NewEnglJMed,2008,359(24):2617-2618[8]TorreA,Vertu-CiolinoD,MazoyerC,etal.Safeguardingfertilitywithwholeovarycryopreservationandmicrovasculartransplantation[J].Transpl,2016,100(9):1889-1897[9]FullerB,PaynterS.Fundamentalsofcryobiologyinreproductivemedicine[J].ReprodBiomedOnline,2004,9(6):680-691[10]MilenkovicM,WallinA,GhahremaniM,etal.Wholesheepovarycryopreservation:evaluationofaslowfreezingprotocolwithdimethylsulphoxide[J].JAssistedReprodGenetics,2011,28(1):7-14.[11]WestphalJR,GerritseR,BraatDDM,etal.Completeprotectionagain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