综述连锁遗传标记方面的在法医学实践研究的进展
摘要：将紧密连锁的两个或多个遗传标记视作一个整体,可得到一种新型连锁遗传标记,依据组成成分的不同,可以分为SNP-STR.微单倍型.Multi-InDel.DIP-STR等.此类标记具有多态性高.突变率低.扩增片段短等特点,可以作为主流遗传标记的有效补充,用于混合斑鉴定.族源推断.亲权鉴定.个体识别 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com
等.本文综述了连锁遗传标记的提出.筛选.命名.检测方法.应用等方面的研究进展,以期为提供参考.关键字：法医遗传学;连锁遗传标记;混合斑;族源推断;微单倍型;AdvancesinstudiesonthenewtypeoflinkagegeneticmarkerLiuCongXiaoChaoHuangYujieHuangDaixinDepartmentofForensicMedicine,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnologyAbstract：Anewtypeoflinkagegeneticmarkercanbeobtainedbydetectingtwoormoregeneticmarkerscloselylinkedtoeachotherasawhole.TheycanbedividedintoSNP-STR,microhaplotype,Multi-InDelandDIP-STRaccordingtothedifferencesofthecomposition.Thesemarkersarecharacterizedbytheirhighpolymorphisms,lowmutationratesandshortamplificationfragments,sotheycanbeusedasaneffectivesupplementforcurrentgeneticmarkersinunbalancedDNAmixturesanalysis,ancestryinference,paternitytestingandindividualidentification.Inthispaper,wereviewedtheresearchprogressesoflinkagegeneticmarkers,includingintroduction,selection,naming,detectionmethodsandapplications,providingreferencesforforensicpractice.Keyword：forensicgenetics;linkagegeneticmarker;DNAmixtures;ancestryinference;microhaplotype;短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR).单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)和插入/缺失多态性(insertionordeletion,InDel)是目前法医物证鉴定的常用遗传标记,但其在应用中的限制也日益受到关注,比如STR的扩增片段较长,不利于降解检材的检测,且突变率较高;SNP和InDel多态性低,需要较多位点才能达到理想的系统效能.连锁遗传标记是指紧密连锁的两个或多个遗传标记组成的复合标记,具有多态性高.突变率低.扩增片段短等特点,因此近年来逐渐受到法医研究者的重视.理论上,STR.SNP.InDel三种遗传标记之间两两组合可组成六种连锁标记.但因STR-STR连锁标记扩增片段较长,法医学应用受限;InDel-SNP的研究尚处于探索起步阶段,这两种标记的相关文献甚少.故本文主要介绍SNP-STR.微单倍型.Multi-InDel.DIP-STR四种连锁标记.1新型连锁遗传标记概述1.1连锁遗传标记的提出2002年,Mountain等[1]首次提出SNP-STR标记并应用于推断群体历史和突变进程.2010年,Ge等[2]提出将紧密连锁的两个或多个SNP标记视为一个整体,命名为Haplotypeblock.无独有偶,耶鲁大学Kidd教授团队先后提出小单倍型(Mini-haplotypes)和微单倍型(microhaplotypes)的概念,SNP相距从10kb缩小到200~300bp以内[3,4].就目前研究来看,法医学应用价值最大的是微单倍型.2013年,Castella等[5]提出DIP-STR标记并用于混合斑鉴定.2014年,Huang等[6]将两个或多个InDel连锁组成的Multi-InDel用于个体识别.不难看出,连锁遗传标记作为一种新兴标记,已逐渐成为法医遗传学研究热点.1.2连锁遗传标记的筛选不同连锁标记有不同的筛选纳入标准[4,6-9]:(1)连锁标记内部各遗传标记相距小于200~300bp;(2)扩增片段长度小于300bp(含STR的除外);(3)各等位基因片段长度差异小于20~40bp;(4)最小单倍型频率大于0.1~0.2;(5)位于非编码区,且各连锁标记之间处于连锁平衡状态.此外,当标记应用于族源推断时,还应满足在目标人群间等位基因频率分布差异显著等特征.1.3连锁遗传标记的命名目前尚无连锁遗传标记的统一命名原则,大多以rs编号.rs编号联合STR名称或以实验室独立编号进行命名.最近,Kidd[10]提出了微单倍型的命名建议,以mh+染色体号+实验室名称-微单倍型编号命名,比如mh01KK-001代表Kidd实验室公开发表的第一个位于1号染色体上的微单倍型.1.4连锁遗传标记的检测方法连锁遗传标记的组成类型不同,检测方法也各异.SNP-STR标记目前主要使用扩增阻滞突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)技术进行检测.设计两条标记不同荧光的SNP等位基因特异性上游引物,及一条STR下游引物进行扩增,两种上游引物末端序列不同,只能靶向性结合相应的SNP等位基因,不能与另一等位基因序列结合延伸.电泳分离扩增产物,通过产物峰的荧光颜色确定SNP等位基因,通过片段大小确定STR等位基因,两种信息组合得出SNP-STR分型.同理,DIP-STR标记也可以通过设计针对InDel位点的等位基因特异性上游引物和STR下游引物,实现扩增检测,两种上游引物长度不同.这两种方法使用毛细管电泳平台即可检测,普适性强,但因每个连锁标记需设计3条引物且使用两色荧光标记,致使可复合扩增检测的标记数量受限.此外,需注意的是,有些SNP-STR标记采用ARMS原理设计的SNP等位基因特异性引物的特异性并不强,易引起非特异性扩增.InDel属于长度多态性标记,Multi-InDel是InDels的线性组合,可使用毛细管电泳平台检测,直接依据片段长度进行分型[6],此法方便快捷,实用性强,但不能区分长度相同.序列不同的Multi-InDel位点,间接降低了Multi-InDel标记的多态性.微单倍型可使用单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism,SSCP)分析[11]或高分辨率熔解曲线(High-ResolutionMelting,HRM)[9]等方法进行检测.SSCP分析的原理是单链DNA的序列不同导致空间构象存在差异,进而改变电泳迁移率,通过观察目的片段带型以完成分型.PCR-SSCP技术不能一次检测多个位点,通量小,且对电泳的条件要求较高.HRM是一种单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术,灵敏度极高,可以检测出单个碱基的差异,具有成本低.通量高.速度快.结果准确的特点.但SSCP和HRM只能检测到基因型差异,不能直接获得DNA序列信息.下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术适用于所有连锁遗传标记的检测,可以直接获取序列信息以完成分型,具有通量高.准确性好且适合于所有类型连锁遗传标记检测等特点,是最理想的连锁遗传标记检测手段.但测序仪器昂贵,普通法医实验室难以开展.随着测序技术的不断优化及测序平台的普及,有望成为连锁遗传标记的主流检测技术.2新型连锁遗传标记的法医学应用2.1在混合斑鉴定中的应用不平衡混合斑鉴定是法医学实践中的难点.针对此,学者们开展了大量研究,涌现出差异裂解法.激光捕获显微切割技术.Y-STR分析.抗体磁珠.高通量测序等多种鉴定方法,这些方法虽各具优势,也各有不足.连锁遗传标记作为一种辅助检测手段,在混合斑鉴定中愈发受到重视.不平衡混合斑检验的关键是获得次要成分的分型,在次要成分具有主要成分中不存在的等位基因的前提下,利用等位基因特异性引物对DIP-STR或SNP-STR标记中的次要成分等位基因进行扩增,可以有效排除主要成分的干扰,获得次要成分的准确分型.这两种标记具有以下特点:(1)灵敏度高.应用SNP-STR标记可从1:40的混合斑中得到次要成分的分型[12].即使比例超过1:16000的混合成分中只有pg级的嫌疑人DNA,Oldoni等[13]使用DIP-STR标记仍能成功检测出10个位点.(2)无需考虑混合斑来源个体的性别.Y-STR在异性混合斑鉴定中具有重要作用,但无法解决同性混合斑问题,而Oldoni等[14]发现DIP-STR表现出与Y-STR相似的灵敏度,并且有相似的等位基因丢失现象,研究表明DIP-STR可以与Y-STR互补使用,并在同性混合斑鉴定时发挥作用.(3)检案效能优异.DIP-STR或SNP-STR标记多常规STR位点筛选获得,这些STR位点多态性高,且群体调查资料较为完善,等位基因频率大多已知,10个DIP-STR位点匹配概率可达1×10-10[8].孕妇外周血中含有母亲DNA和胎儿游离DNA,是一种典型的不平衡比例混合样本.Castella等[5]将DIP-STR标记用于检测30周和36周孕龄的孕妇血浆,结果均获得了胎儿DNA的正确分型,展现了DIP-STR在无创性产前亲权鉴定中的应用潜力,但其在早期孕龄(8~10周)样本中的应用仍需进一步研究.伴随STR扩增出现的影子峰对混合斑分型有很大干扰,SNP标记不存在影子峰现象,但本身属于二等位基因标记,多态性低,应用有限.而微单倍型不存在影子峰干扰,等位基因多态性高,因此兼具STR和SNP标记的优势,适用于混合斑鉴定.Kidd等对此进行了研究,并引入了有效等位基因数目的概念(effectivenumberofalleles,Ae),以对微单倍型的应用价值进行评估.Ae指一个基因座上频率相等或相近的等位基因的数目[15],一般来说,微单倍型包含的SNP个数与Ae值及其应用价值呈正相关.28个Ae值大于3的微单倍型位点区分混合斑的效能高达0.9999999875[16].2.2在人群结构分析与族源推断中的应用现场生物检材的族源推断有助于缩小侦察范围.如今,祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)已经成为了族源推断的重要工具,AIM-SNP和AIM-InDel标记发挥了重要作用.然而研究表明等位基因较多的基因座更有利于评估遗传距离[17],因此微单倍型和Multi-InDel相比SNP和InDel在人群结构分析和族源推断方面更具优势.Lucie等[18]通过比较SNP与单倍型,发现应用后者可使人群错误分型率减少26%~97%.例如,在区分法国和德国人群时,被错误分配的个体减少了73%.Kidd等[4]使用31个微单倍型位点对全球54个群体进行了分析,这些微单倍型可以区分非洲.西南亚.东亚.太平洋地区及美洲人群,但族源推断的效能低于之前报道的55个SNP的复合体系,这是由于构建该微单倍型体系的初衷是亲权鉴定,因此筛选时并未考虑Fst值.2017年,Chen等[11]调查了中国汉.藏.壮.侗.维吾尔等五个民族,发现微单倍型位点L18C1A的平均杂合度为0.61,相较单独SNP位点的平均杂合度0.41呈现出优势.维吾尔族与汉族之间的基因型频率有明显差异,遗传距离的比较和分子方差分析也表明维吾尔族与其他民族之间有明显的种群分化.有研究指出,10个Multi-InDels的族源推断效能与21个AIM-InDels相当,并有足够的能力区分欧洲.东亚和非洲人群[17].在中国亚人群结构研究领域,Sun等[7]使用包含12个Multi-InDels的复合体系,对来源于西藏藏族和四川汉族的样本进行STRUCTURE族源成分分析,将210例实验样本聚类为两簇,聚类结果与样本来源的族群相一致,10个盲测样本均被准确的归入相应族群.由此可见,Multi-InDel具有良好的族源推断潜能.2.3在亲缘关系鉴定及个体识别中的应用连锁遗传标记相较STR突变率低,相较SNP和InDel多态性高,在亲权鉴定和个体识别中具有优势.Pakstis等[3]在一项涵盖全球45个人群的调查中发现,8个Mini-haplotypes标记的杂合度均大于0.5,普遍高于人群中杂合度最高的SNP.Kidd等[4]使用的31个微单倍型复合体系,其效能与13个CODISSTRs或之前报道的45个SNPs相当,甚至优于后者,具有良好的个体识别和亲权鉴定能力.STR的高突变率可能会使亲子之间的若干位点不符合孟德尔遗传规律,这时存在错误否定亲权的风险.Ye等[19]在一例鉴定中发现,被控父CSF1PO位点基因型为11/13,孩子为12,父权概率99.92%,为了避免错误否定父权,他检测了分布在CSF1PO周围的5个SNPs,发现父子中均存在TGCTC单倍型,由此推测CSF1PO基因座在遗传过程中发生了一步突变,重新计算父权概率为99.998%,最终确信了父权.CSF1PO与周围的5个SNPs可看作是一个SNP-STR标记,随后,他检测了76个个体,共发现了60种单倍型,多态性为0.9709,以上表明SNP-STR可作为一种有效的补充检测标记.Fan等[20]在一例缺乏双亲信息的同父异母姐妹关系鉴定中,使用常规STR检测无法做出排除或认定,但发现有4个X染色体Multi-InDel位点不符合孟德尔遗传规律,从而排除了姐妹关系.Huang等[6]构建的包含20个Multi-InDels的复合体系,父权排除概率和个人识别概率分别为0.9989和0.9999999999994.这些参数和实例表明,Multi-InDel标记在亲权鉴定和个体识别中也极具应用价值.3挑战与展望连锁遗传标记被提出至今只有短短数年,围绕它开展的研究方兴未艾,但连锁遗传标记的发展还存在一些困难和挑战:一方面,连锁遗传标记的群体遗传数据还不完善,尤其缺乏中国人群的遗传数据库,现有基因座的中国人群适用性还有待研究;另一方面,二代测序技术作为连锁遗传标记的最佳检测手段,仪器成本高昂,在法医DNA实验室的普及率低,一定程度上影响了连锁遗传标记的发展.综上,连锁遗传标记还无法取代主流遗传标记,但相信随着技术手段的不断进步,越来越多的研究团队开展相关研究,连锁遗传标记的应用前景将更加广阔.参考文献[1]MountainJL,KnightA,JobinM,etal.SNPSTRs:empiricallyderived,rapidlytyped,autosomalhaplotypesforinferenceofpopulationhistoryandmutationalprocesses[J].GenomeRes,2002,12(11):1766-1772.[2]GeJ,BudowleB,PlanzJV,etal.Haplotypeblock:anewtypeofforensicDNAmarkers[J].IntJLegalMed,2010,124(5):353-361.[3]PakstisAJ,FangR,FurtadoMR,etal.Mini-haplotypesaslineageinformativeSNPsandancestryinferenceSNPs[J].EurJHumGenet,2012,20(11):1148-1154.[4]KiddKK,PakstisAJ,SpeedWC,etal.Currentsequencingtechnologymakesmicrohaplotypesapowerfulnewtypeofgeneticmarkerforforensics[J].ForensicSciIntGenet,2014,12:215-224.[5]CastellaV,GervaixJ,HallD.DIP-STR:highlysensitivemarkersfortheanalysisofunbalancedgenomicmixtures[J].HumMutat,2013,34(4):644-654.[6]HuangJ,LuoH,WeiW,etal.Anovelmethodfortheanalysisof20multi-Indelpolymorphismsanditsforensicapplication[J].Electrophoresis,2014,35(4):487-493.[7]SunK,YeY,LuoT,etal.Multi-InDelanalysisforancestryinferenceofsub-populationsinChina[J].SciRep,2016,6:39797.[8]OldoniF,CastellaV,HallD.AnovelsetofDIP-STRmarkersforimprovedanalysisofchallengingDNAmixtures[J].ForensicSciIntGenet,2015,19:156-164.[9]HiroakiN,KojiF,TetsushiK,etal.Approachesforidentifyingmultiple-SNPhaplotypeblocksforuseinhumanidentification[J].LegMed(Tokyo),2015,17(5):415-420.[10]KiddKK.Proposednomenclatureformicrohaplotypes[J].HumGenomics,2016,10(1):16.[11]ChenP,ZhuJ,PuY,etal.MicrohaplotypeidentifiedandperformedingeneticinvestigationusingPCR-SSCP[J].ForensicSciIntGenet,2017,28:e1-e7.[12]WangL,SchneiderPM,RothschildMA,etal.SNP-STRpolymorphism:Asensitivecompoundmarkerforforensicgeneticapplications[J].ForensicSciIntGenet,2013,4(1):e206-e207.[13]OldoniF,CastellaV,HallD.ApplicationofDIP-STRstosexual/physicalassaultinvestigations:Eightcasereports[J].ForensicSciIntGenet,2017,30:106-113.[14]OldoniF,CastellaV,GrosjeanF,etal.SensitiveDIPSTRmarkersfortheanalysisofunbalancedmixturesfromtouchDNAsamples[J].ForensicSciIntGenet,2017,28:111-117.[15]KiddKK,SpeedWC.Criteriaforselectingmicrohaplotypes:mixturedetectionanddeconvolution[J].InvestigGenet,2015,6:1.[16]KiddKK,SpeedWC,PakstisAJ,etal.Evaluating130microhaplotypesacrossaglobalsetof83populations[J].ForensicSciIntGenet,2017,29:29-37.[17]FanGY,YeY,HouYP.DetectingahierarchicalgeneticpopulationstructureviaMulti-InDelmarkersontheXchromosome[J].SciRep,2016,6:32178.[18]GattepailleLM,JakobssonM.Combiningmarkersintohaplotypescanimprovepopulationstructureinference[J].Genetics,2012,190(1):159-174.[19]YeY,LuoH,LiaoL,etal.AcasestudyofSNPSTRefficiencyinpaternitytestingwithlocusincompatibility[J].ForensicSciIntGenet,2014,9:72-75.[20]FanG,YeY,LuoH,etal.Useofmulti-InDelsasnovelmarkerstoanalyze13X-chromosomehaplotypelociforforensicpurposes[J].Electrophoresis,2015,36(23):2931-2938.
等.本文综述了连锁遗传标记的提出.筛选.命名.检测方法.应用等方面的研究进展,以期为提供参考.关键字：法医遗传学;连锁遗传标记;混合斑;族源推断;微单倍型;AdvancesinstudiesonthenewtypeoflinkagegeneticmarkerLiuCongXiaoChaoHuangYujieHuangDaixinDepartmentofForensicMedicine,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnologyAbstract：Anewtypeoflinkagegeneticmarkercanbeobtainedbydetectingtwoormoregeneticmarkerscloselylinkedtoeachotherasawhole.TheycanbedividedintoSNP-STR,microhaplotype,Multi-InDelandDIP-STRaccordingtothedifferencesofthecomposition.Thesemarkersarecharacterizedbytheirhighpolymorphisms,lowmutationratesandshortamplificationfragments,sotheycanbeusedasaneffectivesupplementforcurrentgeneticmarkersinunbalancedDNAmixturesanalysis,ancestryinference,paternitytestingandindividualidentification.Inthispaper,wereviewedtheresearchprogressesoflinkagegeneticmarkers,includingintroduction,selection,naming,detectionmethodsandapplications,providingreferencesforforensicpractice.Keyword：forensicgenetics;linkagegeneticmarker;DNAmixtures;ancestryinference;microhaplotype;短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR).单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)和插入/缺失多态性(insertionordeletion,InDel)是目前法医物证鉴定的常用遗传标记,但其在应用中的限制也日益受到关注,比如STR的扩增片段较长,不利于降解检材的检测,且突变率较高;SNP和InDel多态性低,需要较多位点才能达到理想的系统效能.连锁遗传标记是指紧密连锁的两个或多个遗传标记组成的复合标记,具有多态性高.突变率低.扩增片段短等特点,因此近年来逐渐受到法医研究者的重视.理论上,STR.SNP.InDel三种遗传标记之间两两组合可组成六种连锁标记.但因STR-STR连锁标记扩增片段较长,法医学应用受限;InDel-SNP的研究尚处于探索起步阶段,这两种标记的相关文献甚少.故本文主要介绍SNP-STR.微单倍型.Multi-InDel.DIP-STR四种连锁标记.1新型连锁遗传标记概述1.1连锁遗传标记的提出2002年,Mountain等[1]首次提出SNP-STR标记并应用于推断群体历史和突变进程.2010年,Ge等[2]提出将紧密连锁的两个或多个SNP标记视为一个整体,命名为Haplotypeblock.无独有偶,耶鲁大学Kidd教授团队先后提出小单倍型(Mini-haplotypes)和微单倍型(microhaplotypes)的概念,SNP相距从10kb缩小到200~300bp以内[3,4].就目前研究来看,法医学应用价值最大的是微单倍型.2013年,Castella等[5]提出DIP-STR标记并用于混合斑鉴定.2014年,Huang等[6]将两个或多个InDel连锁组成的Multi-InDel用于个体识别.不难看出,连锁遗传标记作为一种新兴标记,已逐渐成为法医遗传学研究热点.1.2连锁遗传标记的筛选不同连锁标记有不同的筛选纳入标准[4,6-9]:(1)连锁标记内部各遗传标记相距小于200~300bp;(2)扩增片段长度小于300bp(含STR的除外);(3)各等位基因片段长度差异小于20~40bp;(4)最小单倍型频率大于0.1~0.2;(5)位于非编码区,且各连锁标记之间处于连锁平衡状态.此外,当标记应用于族源推断时,还应满足在目标人群间等位基因频率分布差异显著等特征.1.3连锁遗传标记的命名目前尚无连锁遗传标记的统一命名原则,大多以rs编号.rs编号联合STR名称或以实验室独立编号进行命名.最近,Kidd[10]提出了微单倍型的命名建议,以mh+染色体号+实验室名称-微单倍型编号命名,比如mh01KK-001代表Kidd实验室公开发表的第一个位于1号染色体上的微单倍型.1.4连锁遗传标记的检测方法连锁遗传标记的组成类型不同,检测方法也各异.SNP-STR标记目前主要使用扩增阻滞突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)技术进行检测.设计两条标记不同荧光的SNP等位基因特异性上游引物,及一条STR下游引物进行扩增,两种上游引物末端序列不同,只能靶向性结合相应的SNP等位基因,不能与另一等位基因序列结合延伸.电泳分离扩增产物,通过产物峰的荧光颜色确定SNP等位基因,通过片段大小确定STR等位基因,两种信息组合得出SNP-STR分型.同理,DIP-STR标记也可以通过设计针对InDel位点的等位基因特异性上游引物和STR下游引物,实现扩增检测,两种上游引物长度不同.这两种方法使用毛细管电泳平台即可检测,普适性强,但因每个连锁标记需设计3条引物且使用两色荧光标记,致使可复合扩增检测的标记数量受限.此外,需注意的是,有些SNP-STR标记采用ARMS原理设计的SNP等位基因特异性引物的特异性并不强,易引起非特异性扩增.InDel属于长度多态性标记,Multi-InDel是InDels的线性组合,可使用毛细管电泳平台检测,直接依据片段长度进行分型[6],此法方便快捷,实用性强,但不能区分长度相同.序列不同的Multi-InDel位点,间接降低了Multi-InDel标记的多态性.微单倍型可使用单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism,SSCP)分析[11]或高分辨率熔解曲线(High-ResolutionMelting,HRM)[9]等方法进行检测.SSCP分析的原理是单链DNA的序列不同导致空间构象存在差异,进而改变电泳迁移率,通过观察目的片段带型以完成分型.PCR-SSCP技术不能一次检测多个位点,通量小,且对电泳的条件要求较高.HRM是一种单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术,灵敏度极高,可以检测出单个碱基的差异,具有成本低.通量高.速度快.结果准确的特点.但SSCP和HRM只能检测到基因型差异,不能直接获得DNA序列信息.下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术适用于所有连锁遗传标记的检测,可以直接获取序列信息以完成分型,具有通量高.准确性好且适合于所有类型连锁遗传标记检测等特点,是最理想的连锁遗传标记检测手段.但测序仪器昂贵,普通法医实验室难以开展.随着测序技术的不断优化及测序平台的普及,有望成为连锁遗传标记的主流检测技术.2新型连锁遗传标记的法医学应用2.1在混合斑鉴定中的应用不平衡混合斑鉴定是法医学实践中的难点.针对此,学者们开展了大量研究,涌现出差异裂解法.激光捕获显微切割技术.Y-STR分析.抗体磁珠.高通量测序等多种鉴定方法,这些方法虽各具优势,也各有不足.连锁遗传标记作为一种辅助检测手段,在混合斑鉴定中愈发受到重视.不平衡混合斑检验的关键是获得次要成分的分型,在次要成分具有主要成分中不存在的等位基因的前提下,利用等位基因特异性引物对DIP-STR或SNP-STR标记中的次要成分等位基因进行扩增,可以有效排除主要成分的干扰,获得次要成分的准确分型.这两种标记具有以下特点:(1)灵敏度高.应用SNP-STR标记可从1:40的混合斑中得到次要成分的分型[12].即使比例超过1:16000的混合成分中只有pg级的嫌疑人DNA,Oldoni等[13]使用DIP-STR标记仍能成功检测出10个位点.(2)无需考虑混合斑来源个体的性别.Y-STR在异性混合斑鉴定中具有重要作用,但无法解决同性混合斑问题,而Oldoni等[14]发现DIP-STR表现出与Y-STR相似的灵敏度,并且有相似的等位基因丢失现象,研究表明DIP-STR可以与Y-STR互补使用,并在同性混合斑鉴定时发挥作用.(3)检案效能优异.DIP-STR或SNP-STR标记多常规STR位点筛选获得,这些STR位点多态性高,且群体调查资料较为完善,等位基因频率大多已知,10个DIP-STR位点匹配概率可达1×10-10[8].孕妇外周血中含有母亲DNA和胎儿游离DNA,是一种典型的不平衡比例混合样本.Castella等[5]将DIP-STR标记用于检测30周和36周孕龄的孕妇血浆,结果均获得了胎儿DNA的正确分型,展现了DIP-STR在无创性产前亲权鉴定中的应用潜力,但其在早期孕龄(8~10周)样本中的应用仍需进一步研究.伴随STR扩增出现的影子峰对混合斑分型有很大干扰,SNP标记不存在影子峰现象,但本身属于二等位基因标记,多态性低,应用有限.而微单倍型不存在影子峰干扰,等位基因多态性高,因此兼具STR和SNP标记的优势,适用于混合斑鉴定.Kidd等对此进行了研究,并引入了有效等位基因数目的概念(effectivenumberofalleles,Ae),以对微单倍型的应用价值进行评估.Ae指一个基因座上频率相等或相近的等位基因的数目[15],一般来说,微单倍型包含的SNP个数与Ae值及其应用价值呈正相关.28个Ae值大于3的微单倍型位点区分混合斑的效能高达0.9999999875[16].2.2在人群结构分析与族源推断中的应用现场生物检材的族源推断有助于缩小侦察范围.如今,祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)已经成为了族源推断的重要工具,AIM-SNP和AIM-InDel标记发挥了重要作用.然而研究表明等位基因较多的基因座更有利于评估遗传距离[17],因此微单倍型和Multi-InDel相比SNP和InDel在人群结构分析和族源推断方面更具优势.Lucie等[18]通过比较SNP与单倍型,发现应用后者可使人群错误分型率减少26%~97%.例如,在区分法国和德国人群时,被错误分配的个体减少了73%.Kidd等[4]使用31个微单倍型位点对全球54个群体进行了分析,这些微单倍型可以区分非洲.西南亚.东亚.太平洋地区及美洲人群,但族源推断的效能低于之前报道的55个SNP的复合体系,这是由于构建该微单倍型体系的初衷是亲权鉴定,因此筛选时并未考虑Fst值.2017年,Chen等[11]调查了中国汉.藏.壮.侗.维吾尔等五个民族,发现微单倍型位点L18C1A的平均杂合度为0.61,相较单独SNP位点的平均杂合度0.41呈现出优势.维吾尔族与汉族之间的基因型频率有明显差异,遗传距离的比较和分子方差分析也表明维吾尔族与其他民族之间有明显的种群分化.有研究指出,10个Multi-InDels的族源推断效能与21个AIM-InDels相当,并有足够的能力区分欧洲.东亚和非洲人群[17].在中国亚人群结构研究领域,Sun等[7]使用包含12个Multi-InDels的复合体系,对来源于西藏藏族和四川汉族的样本进行STRUCTURE族源成分分析,将210例实验样本聚类为两簇,聚类结果与样本来源的族群相一致,10个盲测样本均被准确的归入相应族群.由此可见,Multi-InDel具有良好的族源推断潜能.2.3在亲缘关系鉴定及个体识别中的应用连锁遗传标记相较STR突变率低,相较SNP和InDel多态性高,在亲权鉴定和个体识别中具有优势.Pakstis等[3]在一项涵盖全球45个人群的调查中发现,8个Mini-haplotypes标记的杂合度均大于0.5,普遍高于人群中杂合度最高的SNP.Kidd等[4]使用的31个微单倍型复合体系,其效能与13个CODISSTRs或之前报道的45个SNPs相当,甚至优于后者,具有良好的个体识别和亲权鉴定能力.STR的高突变率可能会使亲子之间的若干位点不符合孟德尔遗传规律,这时存在错误否定亲权的风险.Ye等[19]在一例鉴定中发现,被控父CSF1PO位点基因型为11/13,孩子为12,父权概率99.92%,为了避免错误否定父权,他检测了分布在CSF1PO周围的5个SNPs,发现父子中均存在TGCTC单倍型,由此推测CSF1PO基因座在遗传过程中发生了一步突变,重新计算父权概率为99.998%,最终确信了父权.CSF1PO与周围的5个SNPs可看作是一个SNP-STR标记,随后,他检测了76个个体,共发现了60种单倍型,多态性为0.9709,以上表明SNP-STR可作为一种有效的补充检测标记.Fan等[20]在一例缺乏双亲信息的同父异母姐妹关系鉴定中,使用常规STR检测无法做出排除或认定,但发现有4个X染色体Multi-InDel位点不符合孟德尔遗传规律,从而排除了姐妹关系.Huang等[6]构建的包含20个Multi-InDels的复合体系,父权排除概率和个人识别概率分别为0.9989和0.9999999999994.这些参数和实例表明,Multi-InDel标记在亲权鉴定和个体识别中也极具应用价值.3挑战与展望连锁遗传标记被提出至今只有短短数年,围绕它开展的研究方兴未艾,但连锁遗传标记的发展还存在一些困难和挑战:一方面,连锁遗传标记的群体遗传数据还不完善,尤其缺乏中国人群的遗传数据库,现有基因座的中国人群适用性还有待研究;另一方面,二代测序技术作为连锁遗传标记的最佳检测手段,仪器成本高昂,在法医DNA实验室的普及率低,一定程度上影响了连锁遗传标记的发展.综上,连锁遗传标记还无法取代主流遗传标记,但相信随着技术手段的不断进步,越来越多的研究团队开展相关研究,连锁遗传标记的应用前景将更加广阔.参考文献[1]MountainJL,KnightA,JobinM,etal.SNPSTRs:empiricallyderived,rapidlytyped,autosomalhaplotypesforinferenceofpopulationhistoryandmutationalprocesses[J].GenomeRes,2002,12(11):1766-1772.[2]GeJ,BudowleB,PlanzJV,etal.Haplotypeblock:anewtypeofforensicDNAmarkers[J].IntJLegalMed,2010,124(5):353-361.[3]PakstisAJ,FangR,FurtadoMR,etal.Mini-haplotypesaslineageinformativeSNPsandancestryinferenceSNPs[J].EurJHumGenet,2012,20(11):1148-1154.[4]KiddKK,PakstisAJ,SpeedWC,etal.Currentsequencingtechnologymakesmicrohaplotypesapowerfulnewtypeofgeneticmarkerforforensics[J].ForensicSciIntGenet,2014,12:215-224.[5]CastellaV,GervaixJ,HallD.DIP-STR:highlysensitivemarkersfortheanalysisofunbalancedgenomicmixtures[J].HumMutat,2013,34(4):644-654.[6]HuangJ,LuoH,WeiW,etal.Anovelmethodfortheanalysisof20multi-Indelpolymorphismsanditsforensicapplication[J].Electrophoresis,2014,35(4):487-493.[7]SunK,YeY,LuoT,etal.Multi-InDelanalysisforancestryinferenceofsub-populationsinChina[J].SciRep,2016,6:39797.[8]OldoniF,CastellaV,HallD.AnovelsetofDIP-STRmarkersforimprovedanalysisofchallengingDNAmixtures[J].ForensicSciIntGenet,2015,19:156-164.[9]HiroakiN,KojiF,TetsushiK,etal.Approachesforidentifyingmultiple-SNPhaplotypeblocksforuseinhumanidentification[J].LegMed(Tokyo),2015,17(5):415-420.[10]KiddKK.Proposednomenclatureformicrohaplotypes[J].HumGenomics,2016,10(1):16.[11]ChenP,ZhuJ,PuY,etal.MicrohaplotypeidentifiedandperformedingeneticinvestigationusingPCR-SSCP[J].ForensicSciIntGenet,2017,28:e1-e7.[12]WangL,SchneiderPM,RothschildMA,etal.SNP-STRpolymorphism:Asensitivecompoundmarkerforforensicgeneticapplications[J].ForensicSciIntGenet,2013,4(1):e206-e207.[13]OldoniF,CastellaV,HallD.ApplicationofDIP-STRstosexual/physicalassaultinvestigations:Eightcasereports[J].ForensicSciIntGenet,2017,30:106-113.[14]OldoniF,CastellaV,GrosjeanF,etal.SensitiveDIPSTRmarkersfortheanalysisofunbalancedmixturesfromtouchDNAsamples[J].ForensicSciIntGenet,2017,28:111-117.[15]KiddKK,SpeedWC.Criteriaforselectingmicrohaplotypes:mixturedetectionanddeconvolution[J].InvestigGenet,2015,6:1.[16]KiddKK,SpeedWC,PakstisAJ,etal.Evaluating130microhaplotypesacrossaglobalsetof83populations[J].ForensicSciIntGenet,2017,29:29-37.[17]FanGY,YeY,HouYP.DetectingahierarchicalgeneticpopulationstructureviaMulti-InDelmarkersontheXchromosome[J].SciRep,2016,6:32178.[18]GattepailleLM,JakobssonM.Combiningmarkersintohaplotypescanimprovepopulationstructureinference[J].Genetics,2012,190(1):159-174.[19]YeY,LuoH,LiaoL,etal.AcasestudyofSNPSTRefficiencyinpaternitytestingwithlocusincompatibility[J].ForensicSciIntGenet,2014,9:72-75.[20]FanG,YeY,LuoH,etal.Useofmulti-InDelsasnovelmarkerstoanalyze13X-chromosomehaplotypelociforforensicpurposes[J].Electrophoresis,2015,36(23):2931-2938.
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