肠宁舒颗粒有效成分小檗碱含量的测定
肠宁舒颗粒是解放军第一O五医院自制制剂,由黄连.厚朴.苍术.木香.黄芪.水蛭和扁豆7味药材组成,具有运脾和胃,化湿止泻之功效,可用于慢性肠炎.肠功能紊乱(腹泻型).胃肠运动障碍性疾病.原质量标准仅对厚朴.黄连和黄芪三味药材做了薄层鉴别,未建立相关含量测定指标,因此,本研究对方中君药黄连的有效成分小檗 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com
碱进行了含量测定,并对原来的薄层鉴别进行改善,使之更加简便.高效.1仪器和试药1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪(包括四元泵和DAD检测器,安捷伦公司)；BT25S型电子分析天平(德国Sartorius公司)；KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WD-9403型紫外分析仪(北京市六一仪器厂)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂).1.2试剂和药品肠宁舒颗粒(规格：5g/袋,解放军第一O五医院制剂室,批号140812.140901.140922)；厚朴对照药材(批号121285-200301)；小檗碱对照品(批号110713-201212,含量86.7%).黄芪对照药材(批号120974-201311).黄连对照药材(三角叶黄莲,批号120913-201310).厚朴对照药材(批号121285-200301)均购自中国食品药品检定研究院；阴性制剂由本院自制；水为超纯水；甲醇.乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯.2方法和结果2.1薄层鉴别(1)厚朴：取肠宁舒颗粒5g,研细,加甲醇50ml,超声提取20min,滤过,滤液浓缩至干.残渣加20ml水使溶解,用盐酸调pH2~3,加氯仿提取两次,每次20ml,合并提取液,挥干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为厚朴供试品溶液.取厚朴对照药材0.5g,加25ml甲醇,超声提取20min,滤过,滤液浓缩至1ml,作为厚朴对照药材溶液.取除厚朴外处方中其余所有药材,制得阴性颗粒,再按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液.照中华人民共和国药典2015年版四部附录0502薄层色谱法实验[1],吸取上述3种溶液各5μl,点于硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-苯-乙酸乙酯(7∶4∶1)为展开剂展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点清晰.(2)黄芪：取肠宁舒颗粒5g,研细,加乙醇40ml.加热回流20min,放冷滤过,滤液蒸干,残渣加0.3%NaOH15ml溶解,过滤,滤液用稀盐酸调pH5~6,用乙酸乙酯15ml提取,分取乙酸乙酯提取液.用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过,滤液蒸干,残渣加1ml乙酸乙酯溶解作为黄芪供试品溶液.取黄芪对照药材2.0g,同法制成黄芪对照药材溶液.取除黄芪外处方中其余所有药材,制得阴性颗粒,再按上述黄芪供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液.照薄层色谱法实验,吸取上述3种溶液各5μl,点于硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨气中熏,再于紫外光365nm下检视.(3)黄连：取肠宁舒颗粒5g,研细,加甲醇40ml,超声提取30min后回流15min,滤过,取滤液作为黄连供试品溶液.取黄连对照药材0.25g,加甲醇2ml,同法制备黄连对照药材溶液.取除黄连外处方中其余所有药材制得阴性颗粒,再按上述黄连供试品溶液制备方法制得黄连阴性对照溶液.照薄层色谱法实验[1],吸取上述3种溶液各2μl点于硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂,置于用浓氨溶液预饱和30min的展缸内,展开.取出,晾干,置紫外光365nm下检视.结果表明,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,故列入标准正文(见图1).2.2HPLC法测定小檗碱的含量2.2.1色谱条件AgilentEclipsePlusC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(30∶70)(用磷酸调pH为4.0)；检测波长345nm:柱温20℃；流速1.0L/min;进样量：10μl.2.2.2溶液的配制(1)对照品溶液：精密称取小檗碱对照品适量,加甲醇制成97.5μg/ml的溶液,即得.(2)供试品溶液：取肠宁舒颗粒细粉约1g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇-磷酸混合溶液(100∶1)40ml,密塞,称重,超声40min,放冷至室温.用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得.(3)阴性对照液：按处方比例配制缺黄连药材的阴性样品,同法制成阴性对照液.2.2.3专属性(空白对照实验)按照2.2.1项下色谱条件,精密吸取对照品溶液.供试品溶液.阴性对照溶液各10μl,注入HPLC仪测定小檗碱含量.由图2可见,小檗碱在对照品溶液中保留时间为9.892min,在供试品溶液中的保留时间为9.881min,在阴性对照溶液小檗碱的相应位置上无吸收峰.2.2.4线性关系考察精密称取小檗碱对照品适量,用甲醇制成浓度为117.69μg/ml的对照品溶液,逐级稀释制成浓度为49.589.63.306.84.408.94.959.105.50.117.69μg/ml的溶液,各取10μl进样测定.以对照品浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,得回归方程为：Y=19.128X+12.17(r=0.9999,n=6).结果表明,小檗碱含量在49.589~117.69μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系.2.2.5精密度实验连续6次取10μl小檗碱对照品溶液进行含量测定,记录峰面积,结果RSD为0.63%(n=6),表明仪器有良好的精密度.2.2.6稳定性实验精密量取肠宁舒颗粒同一批供试品溶液(批号140922),分别于配制后0.2.4.6.8h测定峰面积,得小檗碱峰面积RSD为2.71%(n=5),表明供试品溶液在8h内稳定性良好.2.2.7重复性实验精密称取同一批(批号140922)的肠宁舒颗粒6份,并按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液6份,连续进样6次,分别记录峰面积.结果制剂中的平均小檗碱含量为0.3217mg/g,RSD为0.18%(n=6),表明本法重复性良好.2.2.8加样回收率实验称取同一批肠宁舒颗粒样品(批号140922),按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液(9份),精密量取1ml,分别置量瓶中,于1~3号量瓶中各精密加入浓度为105.51μg/ml的小檗碱对照品溶液0.5ml,4~6号量瓶中各精密加入1ml,7~9号量瓶中各精密加入1.5ml,按2.2.1项下色谱条件测定,计算回收率.结果小檗碱的回收率在99.2%~102.1%,平均加样回收率为100.43%,RSD为0.96%(n=9).12.2.9样品含量测定分别精密称取批号为140812.140901.140922的肠宁舒颗粒1g,按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液,按2.2.1项下色谱条件测定.结果小檗碱含量分别为(2.130±0.0031).(2.324±0.0036).(2.416±0.0042)mg/g(n=3).2.2.10含量限度的确定根据以上3批样品中小檗碱含量测定结果,结合药材的含量限度,以及生产加工过程中的转移率,将本品含量限度确定为：本品含小檗碱不得<2.1mg/g.3讨论3.1色谱条件的选择(1)流动相比例：参照中华人民共和国药典2015版一部黄连中小檗碱的含量测定方法,进行预实验：以乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(50∶50)为流动相,目标峰未能分开；以乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相,目标峰能很好地分离,因此选用后者为流动相.(2)柱温：进行柱温30[3].25.20℃的筛选,发现制剂的分离度对温度敏感,柱温为20℃时分离效果最好.3.2测定方法的选择(1)提取溶剂的选择：选用乙醇.甲醇分别作为提取溶剂,结果表明用甲醇提取含量最高,因此选用甲醇作为溶剂.(2)提取溶剂比例选择[4]:取同一批(批号140922)肠宁舒颗粒1g,待测物与提取溶剂固液比分别为1∶20.1∶40.1∶60,超声处理40min,按本研究建立的方法测定,小檗碱含量分别为1.6877.2.3237.1.6212mg/g.结果表明,选择固液比1∶40最适宜.[参考文献][1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2015年版四部[S].北京：中国医药科技出版社,2015:附录0502,57-59.StatePharmacopoeiaCommittee.PharmacopoeiaofthePeoplesRepublicofChina.2015ed.Volume4[S].Beijing:ChineseMedicalSciencePress,2015:Appendix0502,57-59.InChinese.[2]康阿龙,王卫峰,汤迎爽.椎间盘热融压敏胶贴膏质量标准的研究[J].药学服务与研究,2016,16(1)：44-47.KANGALong,WANGWeiFeng,TANGYingShuang.Re-searchonthequalitystandardsfortheZhuijianpanplasterbasedontheheat-fusingandpressure-sensitiveadhesive[J].PharmCareRes,2016,16(1)：44-47.InChinesewithEnglishabstract.[3]刘建忠,郭剑华,漆伟,等.痛风消颗粒质量标准研究[J].实用中医药杂志,2015,31(6)：588-590.LIUJianZhong,GUOJianHua,QIWei,etal.ResearchonthequalitystandardsofTongfengxiaogranules[J].JPractTraditChinMed,2015,31(6)：588-590.InChinesewithEnglishabstract.[4]蔡清宇,张沂,郝特,等.HPLC法测定舒利通颗粒中巴马丁和小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(2)：42-44.CAIQingYu,ZHANGYi,HAOTe,etal.DeterminationofpalmatineandberberineinShulitonggranulesbyHPLC[J].ChinJExpTraditMedForm,2010,16(2)：42-44.InChinesewithEnglishabstract.
碱进行了含量测定,并对原来的薄层鉴别进行改善,使之更加简便.高效.1仪器和试药1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪(包括四元泵和DAD检测器,安捷伦公司)；BT25S型电子分析天平(德国Sartorius公司)；KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WD-9403型紫外分析仪(北京市六一仪器厂)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂).1.2试剂和药品肠宁舒颗粒(规格：5g/袋,解放军第一O五医院制剂室,批号140812.140901.140922)；厚朴对照药材(批号121285-200301)；小檗碱对照品(批号110713-201212,含量86.7%).黄芪对照药材(批号120974-201311).黄连对照药材(三角叶黄莲,批号120913-201310).厚朴对照药材(批号121285-200301)均购自中国食品药品检定研究院；阴性制剂由本院自制；水为超纯水；甲醇.乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯.2方法和结果2.1薄层鉴别(1)厚朴：取肠宁舒颗粒5g,研细,加甲醇50ml,超声提取20min,滤过,滤液浓缩至干.残渣加20ml水使溶解,用盐酸调pH2~3,加氯仿提取两次,每次20ml,合并提取液,挥干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为厚朴供试品溶液.取厚朴对照药材0.5g,加25ml甲醇,超声提取20min,滤过,滤液浓缩至1ml,作为厚朴对照药材溶液.取除厚朴外处方中其余所有药材,制得阴性颗粒,再按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液.照中华人民共和国药典2015年版四部附录0502薄层色谱法实验[1],吸取上述3种溶液各5μl,点于硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-苯-乙酸乙酯(7∶4∶1)为展开剂展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点清晰.(2)黄芪：取肠宁舒颗粒5g,研细,加乙醇40ml.加热回流20min,放冷滤过,滤液蒸干,残渣加0.3%NaOH15ml溶解,过滤,滤液用稀盐酸调pH5~6,用乙酸乙酯15ml提取,分取乙酸乙酯提取液.用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过,滤液蒸干,残渣加1ml乙酸乙酯溶解作为黄芪供试品溶液.取黄芪对照药材2.0g,同法制成黄芪对照药材溶液.取除黄芪外处方中其余所有药材,制得阴性颗粒,再按上述黄芪供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液.照薄层色谱法实验,吸取上述3种溶液各5μl,点于硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨气中熏,再于紫外光365nm下检视.(3)黄连：取肠宁舒颗粒5g,研细,加甲醇40ml,超声提取30min后回流15min,滤过,取滤液作为黄连供试品溶液.取黄连对照药材0.25g,加甲醇2ml,同法制备黄连对照药材溶液.取除黄连外处方中其余所有药材制得阴性颗粒,再按上述黄连供试品溶液制备方法制得黄连阴性对照溶液.照薄层色谱法实验[1],吸取上述3种溶液各2μl点于硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂,置于用浓氨溶液预饱和30min的展缸内,展开.取出,晾干,置紫外光365nm下检视.结果表明,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,故列入标准正文(见图1).2.2HPLC法测定小檗碱的含量2.2.1色谱条件AgilentEclipsePlusC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(30∶70)(用磷酸调pH为4.0)；检测波长345nm:柱温20℃；流速1.0L/min;进样量：10μl.2.2.2溶液的配制(1)对照品溶液：精密称取小檗碱对照品适量,加甲醇制成97.5μg/ml的溶液,即得.(2)供试品溶液：取肠宁舒颗粒细粉约1g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇-磷酸混合溶液(100∶1)40ml,密塞,称重,超声40min,放冷至室温.用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得.(3)阴性对照液：按处方比例配制缺黄连药材的阴性样品,同法制成阴性对照液.2.2.3专属性(空白对照实验)按照2.2.1项下色谱条件,精密吸取对照品溶液.供试品溶液.阴性对照溶液各10μl,注入HPLC仪测定小檗碱含量.由图2可见,小檗碱在对照品溶液中保留时间为9.892min,在供试品溶液中的保留时间为9.881min,在阴性对照溶液小檗碱的相应位置上无吸收峰.2.2.4线性关系考察精密称取小檗碱对照品适量,用甲醇制成浓度为117.69μg/ml的对照品溶液,逐级稀释制成浓度为49.589.63.306.84.408.94.959.105.50.117.69μg/ml的溶液,各取10μl进样测定.以对照品浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,得回归方程为：Y=19.128X+12.17(r=0.9999,n=6).结果表明,小檗碱含量在49.589~117.69μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系.2.2.5精密度实验连续6次取10μl小檗碱对照品溶液进行含量测定,记录峰面积,结果RSD为0.63%(n=6),表明仪器有良好的精密度.2.2.6稳定性实验精密量取肠宁舒颗粒同一批供试品溶液(批号140922),分别于配制后0.2.4.6.8h测定峰面积,得小檗碱峰面积RSD为2.71%(n=5),表明供试品溶液在8h内稳定性良好.2.2.7重复性实验精密称取同一批(批号140922)的肠宁舒颗粒6份,并按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液6份,连续进样6次,分别记录峰面积.结果制剂中的平均小檗碱含量为0.3217mg/g,RSD为0.18%(n=6),表明本法重复性良好.2.2.8加样回收率实验称取同一批肠宁舒颗粒样品(批号140922),按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液(9份),精密量取1ml,分别置量瓶中,于1~3号量瓶中各精密加入浓度为105.51μg/ml的小檗碱对照品溶液0.5ml,4~6号量瓶中各精密加入1ml,7~9号量瓶中各精密加入1.5ml,按2.2.1项下色谱条件测定,计算回收率.结果小檗碱的回收率在99.2%~102.1%,平均加样回收率为100.43%,RSD为0.96%(n=9).12.2.9样品含量测定分别精密称取批号为140812.140901.140922的肠宁舒颗粒1g,按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液,按2.2.1项下色谱条件测定.结果小檗碱含量分别为(2.130±0.0031).(2.324±0.0036).(2.416±0.0042)mg/g(n=3).2.2.10含量限度的确定根据以上3批样品中小檗碱含量测定结果,结合药材的含量限度,以及生产加工过程中的转移率,将本品含量限度确定为：本品含小檗碱不得<2.1mg/g.3讨论3.1色谱条件的选择(1)流动相比例：参照中华人民共和国药典2015版一部黄连中小檗碱的含量测定方法,进行预实验：以乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(50∶50)为流动相,目标峰未能分开；以乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相,目标峰能很好地分离,因此选用后者为流动相.(2)柱温：进行柱温30[3].25.20℃的筛选,发现制剂的分离度对温度敏感,柱温为20℃时分离效果最好.3.2测定方法的选择(1)提取溶剂的选择：选用乙醇.甲醇分别作为提取溶剂,结果表明用甲醇提取含量最高,因此选用甲醇作为溶剂.(2)提取溶剂比例选择[4]:取同一批(批号140922)肠宁舒颗粒1g,待测物与提取溶剂固液比分别为1∶20.1∶40.1∶60,超声处理40min,按本研究建立的方法测定,小檗碱含量分别为1.6877.2.3237.1.6212mg/g.结果表明,选择固液比1∶40最适宜.[参考文献][1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2015年版四部[S].北京：中国医药科技出版社,2015:附录0502,57-59.StatePharmacopoeiaCommittee.PharmacopoeiaofthePeoplesRepublicofChina.2015ed.Volume4[S].Beijing:ChineseMedicalSciencePress,2015:Appendix0502,57-59.InChinese.[2]康阿龙,王卫峰,汤迎爽.椎间盘热融压敏胶贴膏质量标准的研究[J].药学服务与研究,2016,16(1)：44-47.KANGALong,WANGWeiFeng,TANGYingShuang.Re-searchonthequalitystandardsfortheZhuijianpanplasterbasedontheheat-fusingandpressure-sensitiveadhesive[J].PharmCareRes,2016,16(1)：44-47.InChinesewithEnglishabstract.[3]刘建忠,郭剑华,漆伟,等.痛风消颗粒质量标准研究[J].实用中医药杂志,2015,31(6)：588-590.LIUJianZhong,GUOJianHua,QIWei,etal.ResearchonthequalitystandardsofTongfengxiaogranules[J].JPractTraditChinMed,2015,31(6)：588-590.InChinesewithEnglishabstract.[4]蔡清宇,张沂,郝特,等.HPLC法测定舒利通颗粒中巴马丁和小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(2)：42-44.CAIQingYu,ZHANGYi,HAOTe,etal.DeterminationofpalmatineandberberineinShulitonggranulesbyHPLC[J].ChinJExpTraditMedForm,2010,16(2)：42-44.InChinesewithEnglishabstract.
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