碳纳米管处理对蝴蝶兰种子萌发和幼苗生长的影响
摘要：以蝴蝶兰为材料，采用无菌播种技术，通过在培养基中添加不同浓度的碳纳米管（0、25、50、100、200mg/L）来研究其对蝴蝶兰种子萌发及其幼苗生长的影响，以探明最适合蝴蝶兰种子萌发及幼苗生长的碳纳米管浓度。同时测定相关生理指标，包括原球茎的长度、宽度，幼苗的鲜重、叶长、叶宽、株高，叶片的可溶性糖和可溶性蛋白质含量。试验结果表明：碳纳米管处理在25-100mg/L浓度范围内对蝴蝶兰种子的萌发有抑制作用，浓度越高，抑制越明显；碳纳米管处理对蝴蝶兰幼苗的生长具有促进作用，50-100mg/L时促进生长效果较好。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2 蝴蝶兰种子表面灭菌 2
1.3 无菌播种及碳纳米管处理2
1.4 原球茎的形成及增殖培养3
1.5 碳纳米管对蝴蝶兰分化的影响3
1.6 生理指标测定3
1.61 可溶性蛋白3
1.62 可溶性糖3
1.7 数据分析3
2 结果及分析3
2.1 碳纳米管对蝴蝶兰种子萌发的影响3
2.2 碳纳米管对蝴蝶兰幼苗生长的影响3
2.3 蝴蝶兰幼苗经不同浓度CNTs处理后的生理指标测定结果5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
碳纳米管处理对蝴蝶兰种子萌发和幼苗生长的影响
引言
蝴蝶兰(Phalaenopsis)?又称蝶兰，为兰科蝴蝶兰属植物。其花色丰富艳丽，花期持久，花姿优雅，素有“兰花皇后”的美誉。人工栽培蝴蝶兰已有一百多年的历史，但由于蝴蝶兰种子极其微小，不含有为种子萌发提供营养的胚乳或其它组织，胚发育不完全，在自然条件下很难萌发，且蝴蝶兰属于单茎性兰，只有一个生长点，又不易通过分株来繁殖，所以，蝴蝶兰显得弥足珍贵。随着科学技术的进步，蝴蝶兰种子可以在人工配制的培养基中发芽并长成小苗，从而使得蝴蝶兰的养殖取得飞速的发展[1]。
我国台湾是蝴蝶兰原产地之一，品种培育及栽培技术均有
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
较高的水平，每年有大量的种苗出口到外国。日本蝴蝶兰产业稳定，每年有1000万盆左右开花株上市。美国近年来种植面积增长迅猛，年销成品花数量在1000万株以上。花卉王国荷兰更达到到了年产1200多万盆的数量[1]。我国从20世纪80年代开始蝴蝶兰的引进和开发，至90年代初期，仍处于研究的状态。但目前国内已有较多单位开展相关研究，并建立了蝴蝶兰的无菌播种和无性繁殖技术[24]。2002年，国内生产的蝴蝶兰开花株约300万株，主要在广东等企业生产[5]。2003年，全国开花株销售超过700万盆，各类种苗逾千万株，年交易额数亿[1]。2014年蝴蝶兰年宵花产量已达到5000万株[6]。随着人民生活水平的提高，对花卉的需求不断上升，蝴蝶兰得到了普通大众的认可，其种植面积不断地扩大。
自20世纪80年代，生物技术在蝴蝶兰上成功应用后，终于实现了蝴蝶兰的工厂化生产。目前，组织培养技术已成为蝴蝶兰种苗规模化生产的重要途径。另外，蝴蝶兰可以和兰科其它属的品种人工杂交，产生更加丰富多彩的花形花色，形成新的品种，而兰科种子的无菌培养是蝴蝶兰杂交育种的关键技术，因此蝴蝶兰种子的无菌播种及萌发技术尤为重要。尽管蝴蝶兰种子的无菌播种极大地促进了蝴蝶兰繁殖及育种，但其生长发育较为缓慢（从播种到出瓶需8个月左右，再到开花需两年左右），是制约蝴蝶兰研究及新品种推广应用的一大难题。若能解决蝴蝶兰生长发育缓慢的这一难题，节约时间成本，则蝴蝶兰的科学研究必将取得更大的进展。
近年来，有文献报道称，利用适当浓度的碳纳米管（Carbon nanotube，CNTs）处理番茄种子，可以在种皮表面形成微小伤口，促进细胞对水分及养分的吸收，从而促进番茄种子萌发[7]。也有文献称，石墨烯对水稻种子萌发有一定的抑制作用，而对于水稻幼苗的形态建成方面，高浓度石墨烯处理表现为抑制作用，而低浓度处理却表现为促进作用[8]。但将碳纳米管用于蝴蝶兰的研究未见诸报道，本研究借鉴前人成果，采用无菌播种技术，通过控制不同浓度的碳纳米管来探讨其对蝴蝶兰种子萌发及其幼苗生长的影响。
1 材料与方法
1．1 试验材料
选优良蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’自交种子，开花株授粉生长35个月的蒴果成熟但未开裂的种子用于无菌播种试验。
1．2 蝴蝶兰种子表面灭菌
成熟蒴果经流水冲洗后，拿到超净工作台上，先用75% 的乙醇处理1 min，再用12% 的NaClO浸泡20 min，用无菌水冲洗45次，取出蒴果放在无菌的培养皿中。
1．3 无菌播种及碳纳米管处理
培养基：MS＋香蕉泥100g/L；同时分别添加0、25、50、100mg/L的CNTs，各重复3次。在超净工作台上，用无菌手术刀将果荚前后端各切下1 cm ，中间段纵切，然后用用稀释法播种。稀释法：将纵切的一段果荚浸入无菌水中，轻摇以使种子脱落，随后轻晃无菌水，使种子扩散均匀，数量约在108 粒/ ml；用吸管吸取一定量该种悬液，用等量的无菌水稀释，数量约106 粒/ ml 。最后分别取一定量种子悬液倒到培养基上，晃匀即可。培养条件：温度 23 ℃25 ℃；光照10h/d12h/d，光照强度为1200 Lx1600 Lx。定期观察并测定其发芽速率及发芽率。
1．4 原球茎的形成及增殖培养
培养基：MS＋香蕉泥100g/L，各重复3次。将蝴蝶兰种子萌发形成的原球茎，在诱导培养基上进行培养；将诱导获得的小原球茎从分支处分开，转接到增殖培养基上，进行继代增殖。培养条件：每天光照812h，光照强度为2000 Lx，温度（25±2）℃。
1．5 碳纳米管对蝴蝶兰分化的影响
培养基：MS＋6BA 0.1mg/L＋香蕉泥80g/L＋蔗糖20g/L＋琼脂粉 7.0g/L；同时分别添加0、25、50、100mg/L的CNTs，各重复3次。将经过增殖培养的原球茎转入分化培养基中进行分化培养，培养条件与继代增殖培养相同。定期观察并测定其叶片的生理指标。
1．6 生理指标测定
1．6．1 可溶性蛋白质含量 可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G250比色法。考马斯亮蓝G250(Coomassie?brilliant?blue?G250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（11000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
1．6．2 可溶性糖含量 可溶性糖含量的测定采用蒽酮法。糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2 蝴蝶兰种子表面灭菌 2
1.3 无菌播种及碳纳米管处理2
1.4 原球茎的形成及增殖培养3
1.5 碳纳米管对蝴蝶兰分化的影响3
1.6 生理指标测定3
1.61 可溶性蛋白3
1.62 可溶性糖3
1.7 数据分析3
2 结果及分析3
2.1 碳纳米管对蝴蝶兰种子萌发的影响3
2.2 碳纳米管对蝴蝶兰幼苗生长的影响3
2.3 蝴蝶兰幼苗经不同浓度CNTs处理后的生理指标测定结果5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
碳纳米管处理对蝴蝶兰种子萌发和幼苗生长的影响
引言
蝴蝶兰(Phalaenopsis)?又称蝶兰，为兰科蝴蝶兰属植物。其花色丰富艳丽，花期持久，花姿优雅，素有“兰花皇后”的美誉。人工栽培蝴蝶兰已有一百多年的历史，但由于蝴蝶兰种子极其微小，不含有为种子萌发提供营养的胚乳或其它组织，胚发育不完全，在自然条件下很难萌发，且蝴蝶兰属于单茎性兰，只有一个生长点，又不易通过分株来繁殖，所以，蝴蝶兰显得弥足珍贵。随着科学技术的进步，蝴蝶兰种子可以在人工配制的培养基中发芽并长成小苗，从而使得蝴蝶兰的养殖取得飞速的发展[1]。
我国台湾是蝴蝶兰原产地之一，品种培育及栽培技术均有
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
较高的水平，每年有大量的种苗出口到外国。日本蝴蝶兰产业稳定，每年有1000万盆左右开花株上市。美国近年来种植面积增长迅猛，年销成品花数量在1000万株以上。花卉王国荷兰更达到到了年产1200多万盆的数量[1]。我国从20世纪80年代开始蝴蝶兰的引进和开发，至90年代初期，仍处于研究的状态。但目前国内已有较多单位开展相关研究，并建立了蝴蝶兰的无菌播种和无性繁殖技术[24]。2002年，国内生产的蝴蝶兰开花株约300万株，主要在广东等企业生产[5]。2003年，全国开花株销售超过700万盆，各类种苗逾千万株，年交易额数亿[1]。2014年蝴蝶兰年宵花产量已达到5000万株[6]。随着人民生活水平的提高，对花卉的需求不断上升，蝴蝶兰得到了普通大众的认可，其种植面积不断地扩大。
自20世纪80年代，生物技术在蝴蝶兰上成功应用后，终于实现了蝴蝶兰的工厂化生产。目前，组织培养技术已成为蝴蝶兰种苗规模化生产的重要途径。另外，蝴蝶兰可以和兰科其它属的品种人工杂交，产生更加丰富多彩的花形花色，形成新的品种，而兰科种子的无菌培养是蝴蝶兰杂交育种的关键技术，因此蝴蝶兰种子的无菌播种及萌发技术尤为重要。尽管蝴蝶兰种子的无菌播种极大地促进了蝴蝶兰繁殖及育种，但其生长发育较为缓慢（从播种到出瓶需8个月左右，再到开花需两年左右），是制约蝴蝶兰研究及新品种推广应用的一大难题。若能解决蝴蝶兰生长发育缓慢的这一难题，节约时间成本，则蝴蝶兰的科学研究必将取得更大的进展。
近年来，有文献报道称，利用适当浓度的碳纳米管（Carbon nanotube，CNTs）处理番茄种子，可以在种皮表面形成微小伤口，促进细胞对水分及养分的吸收，从而促进番茄种子萌发[7]。也有文献称，石墨烯对水稻种子萌发有一定的抑制作用，而对于水稻幼苗的形态建成方面，高浓度石墨烯处理表现为抑制作用，而低浓度处理却表现为促进作用[8]。但将碳纳米管用于蝴蝶兰的研究未见诸报道，本研究借鉴前人成果，采用无菌播种技术，通过控制不同浓度的碳纳米管来探讨其对蝴蝶兰种子萌发及其幼苗生长的影响。
1 材料与方法
1．1 试验材料
选优良蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’自交种子，开花株授粉生长35个月的蒴果成熟但未开裂的种子用于无菌播种试验。
1．2 蝴蝶兰种子表面灭菌
成熟蒴果经流水冲洗后，拿到超净工作台上，先用75% 的乙醇处理1 min，再用12% 的NaClO浸泡20 min，用无菌水冲洗45次，取出蒴果放在无菌的培养皿中。
1．3 无菌播种及碳纳米管处理
培养基：MS＋香蕉泥100g/L；同时分别添加0、25、50、100mg/L的CNTs，各重复3次。在超净工作台上，用无菌手术刀将果荚前后端各切下1 cm ，中间段纵切，然后用用稀释法播种。稀释法：将纵切的一段果荚浸入无菌水中，轻摇以使种子脱落，随后轻晃无菌水，使种子扩散均匀，数量约在108 粒/ ml；用吸管吸取一定量该种悬液，用等量的无菌水稀释，数量约106 粒/ ml 。最后分别取一定量种子悬液倒到培养基上，晃匀即可。培养条件：温度 23 ℃25 ℃；光照10h/d12h/d，光照强度为1200 Lx1600 Lx。定期观察并测定其发芽速率及发芽率。
1．4 原球茎的形成及增殖培养
培养基：MS＋香蕉泥100g/L，各重复3次。将蝴蝶兰种子萌发形成的原球茎，在诱导培养基上进行培养；将诱导获得的小原球茎从分支处分开，转接到增殖培养基上，进行继代增殖。培养条件：每天光照812h，光照强度为2000 Lx，温度（25±2）℃。
1．5 碳纳米管对蝴蝶兰分化的影响
培养基：MS＋6BA 0.1mg/L＋香蕉泥80g/L＋蔗糖20g/L＋琼脂粉 7.0g/L；同时分别添加0、25、50、100mg/L的CNTs，各重复3次。将经过增殖培养的原球茎转入分化培养基中进行分化培养，培养条件与继代增殖培养相同。定期观察并测定其叶片的生理指标。
1．6 生理指标测定
1．6．1 可溶性蛋白质含量 可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G250比色法。考马斯亮蓝G250(Coomassie?brilliant?blue?G250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（11000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
1．6．2 可溶性糖含量 可溶性糖含量的测定采用蒽酮法。糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm。
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