柳枝稷pvpip2;1基因的克隆与表达分析
柳枝稷（Panicum virgatum L.）属禾本科黍属作物，是原产于北美的多年生暖季型优良牧草。其具有耐瘠薄、抗旱、耐盐碱土壤等特性，是水土流失和荒漠化治理的理想植物。近年来，因其生物学产量和乙醇产率高，柳枝稷已成为国际上重要的生物能源植物。本实验用PCR克隆技术从柳枝稷中克隆了PvPIP2;1基因的cDNA。经生物信息学分析，该基因开放阅读框为861 bp，其编码的蛋白含有286个氨基酸，蛋白分子式是 C1373H2111N353O376S9，分子量为29.87 kDa，理论等电点(pI)为8.24。对其同源性的分析表明PvPIP2;1基因与粟（Setaria italica）PIP2-6（93%），玉米（Zea mays L.）PIP2,4（92%）的质膜水通道蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果显示在低温（4℃）、ABA和Nacl胁迫的24小时内其相对表达量均高于对照。此外光周期对其表达也产生重要影响。推测PvPIP2;1基因在柳枝稷的生长发育及逆境胁迫应答中起到重要作用。研究结果将为今后进一步探讨该基因在非生物逆境胁迫中的作用提供基础信息和研究依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1试验材料4
1.1.1植物试验材料4
1.1.2菌种和质粒4
1.1.3工具酶和试剂4
1.1.4主要仪器4
1.2试验方法4
1.2.1 RNA的提取与反转录4
1.2.2 PIP基因的克隆及序列测定4
1.2.3荧光定量PCR分析柳枝稷PIP基因表达特性4
1.2.4 PIP序列的生物信息学分析5
2结果与分析5
2.1柳枝稷PIP基因全长cDNA的克隆和序列分析5
2.2柳枝稷PIP氨基酸序列的组成分析和结构预测6
2.3 柳枝稷PIP同源性和系统进化分析6
2.4 柳枝稷PIP荧光定量PCR结果分析7
3讨论9
4结论10
致谢10
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
10
柳枝稷PvPIP2;1基因的克隆与表达分析
引言
伴随着世界经济与社会的迅速发展，人们对能源的需求量日益剧增。化石能源迅速消耗以及所导致的大气污染、全球气候变暖一系列问题迫使人们寻找传统能源的替代品。利用生物能源作物来生产燃料是一个开创性的理念，国外许多国家特别是美国等对此已进行了十多年的研究，还筛选出了一系列优势作物，如木本植物枫树、白杨、柳树等，但草本能源植物柳枝稷的优势尤为突出[1]。能源作物是重要的生物质能源，它指的是那些一年生以及多年生植物，其栽培目的是生产固体、液体或气体的能源材料；能源作物应具备以下特征：高效太阳能转化，高效水分利用，高效能量产出，高抗逆能力，低生产成本，并且环境友好[2]。
柳枝稷(Panicum virgatum L.)为美洲的本土植物，隶属禾本科黍属，是一种多年生暖季型草本植物，通常被用于水土保持、放牧以及生态建设等[3]。柳枝稷的株高在50~250cm范围内，作为多年生草地植物，其高产期比较长，一般在 10 年以上。与传统作物相比，柳枝稷的抗旱能力强，需肥量少，虫害少，产量高，最高产量可达 74.1 t/hm2。国内外许多学者认为柳枝稷是一种具有较大发展潜力的能源作物[4]。其不仅具有较强适应能力，还有较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊薄能力，并且对环境友好，作为一种具有较大发展潜力的能源作物受到关注。近年来，国际上将其作为一种新型能源模式作物进行了深入研究，用于火力发电，以木质纤维素生产乙醇，还可用于造纸和进行生态环境保护。能源危机使生物能源在全球掀起了研究高潮，美国对于柳枝稷尤为重视[56]。
能源植物不能与粮争地，因此需要重复利用边际地和退化土地。为了进一步提高柳枝稷对边际和退化土地的适应能力，提高其生物产量，有必要进一步增强其抗逆性。处于逆境中的植物，体内会发生一系列的生理生化反应来应答和耐受逆境[7]。首先，植物通过多种途径感应环境变化，然后将这种变化信息传递到细胞内部，细胞内部发生一系列磷酸化级联反应[8]，将信号传递给转录因子，转录因子随后与顺式作用元件结合，启动抗逆基因的表达[9]，从而提高植物的抗逆性。因此，分析植物的抗逆机理，克隆参与抗逆调控的相关基因，能够为抗逆分子育种的开展提供基础。
水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一类从原核生物如细菌到人体和其他哺乳动物都广泛存在的细胞膜上水通透性蛋白，能够选择性地高效跨膜转运水分子。与动物和微生物相比，植物水通道蛋白基因不仅具有丰富的多样性还呈现出极高的丰度。植物质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIP)是水通道蛋白的亚类，目前已发现的水孔蛋白中多数为PIPs。因与膜内在蛋白(membrane intrinsic protein，MIP)序列同源性和结构相似性程度较高，属于MIP超家族成员[1011]。PIPs的分子量在2629kD之间，一般由5个短环相连的6个跨膜a螺旋及伸入胞质的N端和C端组成。水孔蛋白的一级结构呈现出内部同源性，推测为是基因内部扩增而成。两个由3个氨基酸组成的结构域——NAP盒(aPsProala box)高度保守，几乎存在于所有已知的水孔蛋白中，它们参与水通道的形成，对水孔蛋白的功能十分重要[1213]。
分析存在于高等植物中的PIPs发现，其含有两个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN，分别位于C环和E环，猜测可能对PIPs功能的特异性产生影响。由于N端和C端的不同，可以将PIPs分为：PIP1和PIP2，PIP1与PIP2相比，其具有较长的N端和较短的C端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。
实验表明PIPs在多个物种中具有运输水的功能。PIPs能够介导水分和中性分子的跨膜转运，包括甘油、尿素、CO2等。此外，还有研究表明PIPs与对植物氧化应激反应、损伤修复也起到一定作用。于是人们期望通过将PIPs基因转入农作物中并且表达，来提高作物的抗逆能力。最近也有研究发现PIPs在植物细胞生长方面能够起到促进的作用[14]。植物在整个生命周期中，经常受到各种环境因子的影响。环境压力所导致的光合作用减少、氧化损伤、激素变化及胁迫相关蛋白积累，通常会导致植物组织脱水。当植物抵御干旱胁迫、盐胁迫和渗透胁迫时，植物细胞的PIPs通过发生表达水平、蛋白活性和蛋白结构等不同的适应性改变，从而发挥着重要的作用[15]。
植物的生长发育在很大程度上依赖于对水分的严格调控。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic conductivity，Lp）[16]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水分在植物体内的运输主要通过3种途径:共质体途径、质外体途径和跨细胞途径。水分跨细胞运输又可通过2种方式实现：自由扩散和以水孔蛋白为媒介的水分运输。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic conductivity，Lp）[17]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水孔蛋白能增加生物膜对水分的通透性，实现水分快速跨膜运输，有效调节细胞内外的渗透平衡。
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摘要1
关键词1
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Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1试验材料4
1.1.1植物试验材料4
1.1.2菌种和质粒4
1.1.3工具酶和试剂4
1.1.4主要仪器4
1.2试验方法4
1.2.1 RNA的提取与反转录4
1.2.2 PIP基因的克隆及序列测定4
1.2.3荧光定量PCR分析柳枝稷PIP基因表达特性4
1.2.4 PIP序列的生物信息学分析5
2结果与分析5
2.1柳枝稷PIP基因全长cDNA的克隆和序列分析5
2.2柳枝稷PIP氨基酸序列的组成分析和结构预测6
2.3 柳枝稷PIP同源性和系统进化分析6
2.4 柳枝稷PIP荧光定量PCR结果分析7
3讨论9
4结论10
致谢10
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
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柳枝稷PvPIP2;1基因的克隆与表达分析
引言
伴随着世界经济与社会的迅速发展，人们对能源的需求量日益剧增。化石能源迅速消耗以及所导致的大气污染、全球气候变暖一系列问题迫使人们寻找传统能源的替代品。利用生物能源作物来生产燃料是一个开创性的理念，国外许多国家特别是美国等对此已进行了十多年的研究，还筛选出了一系列优势作物，如木本植物枫树、白杨、柳树等，但草本能源植物柳枝稷的优势尤为突出[1]。能源作物是重要的生物质能源，它指的是那些一年生以及多年生植物，其栽培目的是生产固体、液体或气体的能源材料；能源作物应具备以下特征：高效太阳能转化，高效水分利用，高效能量产出，高抗逆能力，低生产成本，并且环境友好[2]。
柳枝稷(Panicum virgatum L.)为美洲的本土植物，隶属禾本科黍属，是一种多年生暖季型草本植物，通常被用于水土保持、放牧以及生态建设等[3]。柳枝稷的株高在50~250cm范围内，作为多年生草地植物，其高产期比较长，一般在 10 年以上。与传统作物相比，柳枝稷的抗旱能力强，需肥量少，虫害少，产量高，最高产量可达 74.1 t/hm2。国内外许多学者认为柳枝稷是一种具有较大发展潜力的能源作物[4]。其不仅具有较强适应能力，还有较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊薄能力，并且对环境友好，作为一种具有较大发展潜力的能源作物受到关注。近年来，国际上将其作为一种新型能源模式作物进行了深入研究，用于火力发电，以木质纤维素生产乙醇，还可用于造纸和进行生态环境保护。能源危机使生物能源在全球掀起了研究高潮，美国对于柳枝稷尤为重视[56]。
能源植物不能与粮争地，因此需要重复利用边际地和退化土地。为了进一步提高柳枝稷对边际和退化土地的适应能力，提高其生物产量，有必要进一步增强其抗逆性。处于逆境中的植物，体内会发生一系列的生理生化反应来应答和耐受逆境[7]。首先，植物通过多种途径感应环境变化，然后将这种变化信息传递到细胞内部，细胞内部发生一系列磷酸化级联反应[8]，将信号传递给转录因子，转录因子随后与顺式作用元件结合，启动抗逆基因的表达[9]，从而提高植物的抗逆性。因此，分析植物的抗逆机理，克隆参与抗逆调控的相关基因，能够为抗逆分子育种的开展提供基础。
水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一类从原核生物如细菌到人体和其他哺乳动物都广泛存在的细胞膜上水通透性蛋白，能够选择性地高效跨膜转运水分子。与动物和微生物相比，植物水通道蛋白基因不仅具有丰富的多样性还呈现出极高的丰度。植物质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIP)是水通道蛋白的亚类，目前已发现的水孔蛋白中多数为PIPs。因与膜内在蛋白(membrane intrinsic protein，MIP)序列同源性和结构相似性程度较高，属于MIP超家族成员[1011]。PIPs的分子量在2629kD之间，一般由5个短环相连的6个跨膜a螺旋及伸入胞质的N端和C端组成。水孔蛋白的一级结构呈现出内部同源性，推测为是基因内部扩增而成。两个由3个氨基酸组成的结构域——NAP盒(aPsProala box)高度保守，几乎存在于所有已知的水孔蛋白中，它们参与水通道的形成，对水孔蛋白的功能十分重要[1213]。
分析存在于高等植物中的PIPs发现，其含有两个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN，分别位于C环和E环，猜测可能对PIPs功能的特异性产生影响。由于N端和C端的不同，可以将PIPs分为：PIP1和PIP2，PIP1与PIP2相比，其具有较长的N端和较短的C端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。
实验表明PIPs在多个物种中具有运输水的功能。PIPs能够介导水分和中性分子的跨膜转运，包括甘油、尿素、CO2等。此外，还有研究表明PIPs与对植物氧化应激反应、损伤修复也起到一定作用。于是人们期望通过将PIPs基因转入农作物中并且表达，来提高作物的抗逆能力。最近也有研究发现PIPs在植物细胞生长方面能够起到促进的作用[14]。植物在整个生命周期中，经常受到各种环境因子的影响。环境压力所导致的光合作用减少、氧化损伤、激素变化及胁迫相关蛋白积累，通常会导致植物组织脱水。当植物抵御干旱胁迫、盐胁迫和渗透胁迫时，植物细胞的PIPs通过发生表达水平、蛋白活性和蛋白结构等不同的适应性改变，从而发挥着重要的作用[15]。
植物的生长发育在很大程度上依赖于对水分的严格调控。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic conductivity，Lp）[16]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水分在植物体内的运输主要通过3种途径:共质体途径、质外体途径和跨细胞途径。水分跨细胞运输又可通过2种方式实现：自由扩散和以水孔蛋白为媒介的水分运输。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic conductivity，Lp）[17]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水孔蛋白能增加生物膜对水分的通透性，实现水分快速跨膜运输，有效调节细胞内外的渗透平衡。
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