锌离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
摘要：以蚂蟥为实验动物，采用静水停食实验法，研究了Zn2+对蚂蟥的急性毒性效应, 得到 Zn2+的安全浓度为0.811 mg/L。安全浓度下喂养蚂蟥60天，生长情况表明，在锌离子影响下前30天生长速度较对照组快。采用 3，5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯( ρ-NPP) 比色法、福林-酚法探究锌溶液养殖的蚂蟥消化酶的活力变化规律，发现当锌离子浓度为0.5mg/L时，消化酶的活性均高于其他组。按药典标准方法测定凝血酶含量及重金属残留量，结果显示凝血酶含量达药典标准，重金属含量均在限量标准范围内。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1.1.实验材料与仪器 2
2 方法 2
2.1 急性毒性试验 2
2.2 生长试验 2
2.3消化酶活性测定 2
2.3.1 酶液制备 2
2.3.2 淀粉酶活力测定 2
2.3.3 脂肪酶活力测定 2
2.3.4 蛋白酶活力测定 2
2.4 抗逆酶测定 2
2.5内在品质测定 3
2.5.1重金属含量测定 3
2.5.2抗凝血酶含量 3
2.6 数据分析 3
3 结果与分析 3
3.1 急性毒性实验结果 3
3.2生长实验结果 4
3.3消化酶实验结果 4
3.4 抗逆酶实验结果 4
3.5内在品质结果 5
3.5.1 凝血酶含量测定 5
3.5.2重金属含量测定结果 5
4 讨论 6
4.1锌离子对蚂蟥的急性毒性作用 6
4.2锌离子对蚂蟥生长及消化酶活性的影响 6
4.3 锌离子对蚂蟥抗逆酶活性的影响 6
4.4锌离子对蚂蟥内在品质的影响 7
致谢 7
参考文献 7
锌离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
引言
蚂蟥（Whi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
tmania Pigra Whitman），《中华人民共和国药典》2015年版收载的三种水蛭之一[1]，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科[2]（Haemo pidae）。其干燥全体是一味传统的中药,性味咸苦平,有小毒,入肝、膀胱经,具有破血、逐瘀、通经之功效。临床研究表明，水蛭对心脑血管疾病具有良好的治疗作用，对肾病综合征、妇科疾病中的乳腺增生等也有很好的治疗作用[34]。近年来，由于国内外现代医学对水蛭的不断深入研究，致使水蛭的需求量逐年增大，入药的水蛭大多数都是从野外采集而来的，但是随着环境污染的严重，水蛭适合生存的环境也越来越少，水蛭的种群数量随之日趋减少，致使野生资源日益枯竭，水蛭药材的供需矛盾更加突出。
重金属是典型的累积性污染物之一，普遍存在于生态环境中，动物一经摄入，便会通过食物链逐级传递和富集，并且会在某些特定条件下转化成毒性更大的金属有机化合物，最终使人类健康受到危害[5]。蚂蟥的饲养方式和生活习性极易致使重金属积聚于体内[67] 。锌元素是水生生物的必需元素，但当水中锌的含量过高时，锌离子多余的量就会与体内某些酶以及核酸等生物大分子结合，最终导致水生动物中毒。
探究不同浓度锌离子对蚂蟥生长以及对消化酶和抗凝血酶活性的影响，分析蚂蟥体内的重金属残留情况，从而探讨其对蚂蟥人工养殖的指导意义，为蚂蟥的大规模、高质量、洁净养殖提供一定的理论依据。
1 材料
1.1.实验材料与仪器
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）
FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、DHG9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、电感耦合等离子体发射光谱仪(2100DC，美国)
0.12mol/L三羟甲基氨基甲烷、凝血酶40U/g(Sigma公司)、牛纤维蛋白原(Sigma公司)、七水合硫酸锌（ZnSO47H2O）
2 方法
2.1 急性毒性试验
试验按照鱼类急性致毒的常规方法进行[8]。先配置不同浓度的锌离子溶液，进行探索性试验，确定出锌离子的试验质量浓度范围。以自然状态为对照,设置五个质量浓度组和一个空白对照组（0、6.68、8.35、10.02、11.69、13.36mg/L）, 采用静水停食实验法。试验共进行4天。观察记录24、48、72、96小时试验蚂蟥存活数和一般现象。由试验所得蚂蟥死亡率数据，通过概率单位法计算得到锌离子对蚂蟥48h、96h的半致死浓度值，进而得出安全浓度。
2.2 生长试验
在安全浓度下，设置6个浓度组（0mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L），每组蚂蟥30条（重4.18±0.93g）。喂养蚂蟥60天，每10天称重一次，试验期间水温25±3℃，观察蚂蟥的存活情况并计算特定生长率。
特定生长率(%)=（㏑(试验末平均体重)－㏑(试验初平均体重)）/试验时间*100%
2.3消化酶活性测定
2.3.1 酶液制备
将活蚂蟥固定在冰盘内解剖，取出其完整的消化道，剔除肠道附着物，用预冷的蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干其表面水分，称重，用匀浆机进行匀浆（冰浴），同时加蒸馏水，稀释成含原浆 20% 的溶液，冷冻离心 10 min( 转速为1万 rmin－1) ，所得上清液为酶液，置于4℃冰箱中低温保存，并在24 h内测定完成。
2.3.2 淀粉酶活力测定
采用 3，5二硝基水杨酸比色法[9]测定淀粉酶活力。在 37 ℃的条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成 1 mg 还原糖的产量为 1 个淀粉酶活力单位。
2.3.3 脂肪酶活力测定
采用对棕榈酸硝基苯酯( ρNPP) 比色法[10]测定脂肪酶活力。在一定反应条件下，1 min 催化释放 1 μmol 对硝基酚的酶量定义为 1 个活力单位( UmL1) 。
2.3.4 蛋白酶活力测定
采用福林酚法[11]测定蛋白酶活力。在 37℃ 和一定的 pH 条件下，每分钟水解干酪素产生 1μg 酪氨酸定义为 1 个蛋白酶活力单位。
2.4 抗逆酶测定
SOD活性的测定采用郑碧玉等[12]的方法，25℃下，1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为1个活力单位（U）。CAT活性采用比色法测定[13]，每分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。ALP活性的测定参考芶琳等[14]的方法，30℃条件下，每分钟产生1μmol的对硝基酚，为1个酶活力单位（U）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料 2
1.1.实验材料与仪器 2
2 方法 2
2.1 急性毒性试验 2
2.2 生长试验 2
2.3消化酶活性测定 2
2.3.1 酶液制备 2
2.3.2 淀粉酶活力测定 2
2.3.3 脂肪酶活力测定 2
2.3.4 蛋白酶活力测定 2
2.4 抗逆酶测定 2
2.5内在品质测定 3
2.5.1重金属含量测定 3
2.5.2抗凝血酶含量 3
2.6 数据分析 3
3 结果与分析 3
3.1 急性毒性实验结果 3
3.2生长实验结果 4
3.3消化酶实验结果 4
3.4 抗逆酶实验结果 4
3.5内在品质结果 5
3.5.1 凝血酶含量测定 5
3.5.2重金属含量测定结果 5
4 讨论 6
4.1锌离子对蚂蟥的急性毒性作用 6
4.2锌离子对蚂蟥生长及消化酶活性的影响 6
4.3 锌离子对蚂蟥抗逆酶活性的影响 6
4.4锌离子对蚂蟥内在品质的影响 7
致谢 7
参考文献 7
锌离子对蚂蟥生长及其内在品质的初步研究
引言
蚂蟥（Whi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
tmania Pigra Whitman），《中华人民共和国药典》2015年版收载的三种水蛭之一[1]，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科[2]（Haemo pidae）。其干燥全体是一味传统的中药,性味咸苦平,有小毒,入肝、膀胱经,具有破血、逐瘀、通经之功效。临床研究表明，水蛭对心脑血管疾病具有良好的治疗作用，对肾病综合征、妇科疾病中的乳腺增生等也有很好的治疗作用[34]。近年来，由于国内外现代医学对水蛭的不断深入研究，致使水蛭的需求量逐年增大，入药的水蛭大多数都是从野外采集而来的，但是随着环境污染的严重，水蛭适合生存的环境也越来越少，水蛭的种群数量随之日趋减少，致使野生资源日益枯竭，水蛭药材的供需矛盾更加突出。
重金属是典型的累积性污染物之一，普遍存在于生态环境中，动物一经摄入，便会通过食物链逐级传递和富集，并且会在某些特定条件下转化成毒性更大的金属有机化合物，最终使人类健康受到危害[5]。蚂蟥的饲养方式和生活习性极易致使重金属积聚于体内[67] 。锌元素是水生生物的必需元素，但当水中锌的含量过高时，锌离子多余的量就会与体内某些酶以及核酸等生物大分子结合，最终导致水生动物中毒。
探究不同浓度锌离子对蚂蟥生长以及对消化酶和抗凝血酶活性的影响，分析蚂蟥体内的重金属残留情况，从而探讨其对蚂蟥人工养殖的指导意义，为蚂蟥的大规模、高质量、洁净养殖提供一定的理论依据。
1 材料
1.1.实验材料与仪器
蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）
FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、DHG9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、电感耦合等离子体发射光谱仪(2100DC，美国)
0.12mol/L三羟甲基氨基甲烷、凝血酶40U/g(Sigma公司)、牛纤维蛋白原(Sigma公司)、七水合硫酸锌（ZnSO47H2O）
2 方法
2.1 急性毒性试验
试验按照鱼类急性致毒的常规方法进行[8]。先配置不同浓度的锌离子溶液，进行探索性试验，确定出锌离子的试验质量浓度范围。以自然状态为对照,设置五个质量浓度组和一个空白对照组（0、6.68、8.35、10.02、11.69、13.36mg/L）, 采用静水停食实验法。试验共进行4天。观察记录24、48、72、96小时试验蚂蟥存活数和一般现象。由试验所得蚂蟥死亡率数据，通过概率单位法计算得到锌离子对蚂蟥48h、96h的半致死浓度值，进而得出安全浓度。
2.2 生长试验
在安全浓度下，设置6个浓度组（0mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L），每组蚂蟥30条（重4.18±0.93g）。喂养蚂蟥60天，每10天称重一次，试验期间水温25±3℃，观察蚂蟥的存活情况并计算特定生长率。
特定生长率(%)=（㏑(试验末平均体重)－㏑(试验初平均体重)）/试验时间*100%
2.3消化酶活性测定
2.3.1 酶液制备
将活蚂蟥固定在冰盘内解剖，取出其完整的消化道，剔除肠道附着物，用预冷的蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干其表面水分，称重，用匀浆机进行匀浆（冰浴），同时加蒸馏水，稀释成含原浆 20% 的溶液，冷冻离心 10 min( 转速为1万 rmin－1) ，所得上清液为酶液，置于4℃冰箱中低温保存，并在24 h内测定完成。
2.3.2 淀粉酶活力测定
采用 3，5二硝基水杨酸比色法[9]测定淀粉酶活力。在 37 ℃的条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成 1 mg 还原糖的产量为 1 个淀粉酶活力单位。
2.3.3 脂肪酶活力测定
采用对棕榈酸硝基苯酯( ρNPP) 比色法[10]测定脂肪酶活力。在一定反应条件下，1 min 催化释放 1 μmol 对硝基酚的酶量定义为 1 个活力单位( UmL1) 。
2.3.4 蛋白酶活力测定
采用福林酚法[11]测定蛋白酶活力。在 37℃ 和一定的 pH 条件下，每分钟水解干酪素产生 1μg 酪氨酸定义为 1 个蛋白酶活力单位。
2.4 抗逆酶测定
SOD活性的测定采用郑碧玉等[12]的方法，25℃下，1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为1个活力单位（U）。CAT活性采用比色法测定[13]，每分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。ALP活性的测定参考芶琳等[14]的方法，30℃条件下，每分钟产生1μmol的对硝基酚，为1个酶活力单位（U）。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zyx/445.html
