子宫缺血再灌注损伤运用丹参提取液的效果

任何子宫手术和有创检查均有可能发生子宫缺血再灌注损伤并影响子宫的生殖功能[1].临床以胎盘早期剥离.子宫破裂.剖宫产.流产引产等手术造成的缺血再灌注损伤为重,近年来研究表明丙二醛(MDA)与组织器官缺血再灌注损伤有关[2].而临床常用的子宫收缩药如缩宫素催产和引产及产后出血均有可能造成子宫收缩止血或 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com 
阻断血管止血的同时造成子宫缺血再灌注损伤[3],故如何减轻或防治子宫缺血再灌注损伤是本研究的目的.活血调经和祛瘀消炎是丹参主要药性,药理研究表明其可抗自由基.抗氧化.扩张血管.增加缺血组织血液流量,抑制缺血区组织细胞内钙超载而发挥对缺血再灌注损伤的组织修复作用[4].本实验通过测定大鼠子宫组织超氧化物歧化酶(SOD).丙二醛(MDA)浓度.Bcl-2和Bax蛋白表达等指标来探讨中药丹参提取液对大鼠子宫缺血再灌注损伤的保护机制,为临床研究子宫缺血再灌注损伤的防治提供理论依据.1材料与方法1.1材料普通级SD雌性大鼠36只,体质量179~245g,由湖北医药实验动物中心提供[许可证号：SYXK(鄂)2011-0031],手术操作均在标准手术室进行[SCXK(鄂)2011-0008].术后动物房温度保持在20~22℃,湿度50%~75%,24h交替光照,分笼饲养动物,自由饮水,普通饲料喂养即可.1.2药物及试剂丹参(十堰市太和医院中药房提供)；水合氯醛(北京化学试剂公司提供)；Bcl-2和Bax蛋白测试盒(北京博凌科为生物科技有限公司提供)；SOD.MDA.乳酸脱氢酶(LDH)和白介素-2(IL-2)试剂盒(南京建成生物工程研究所提供).1.3干预方法先将实验动物编号,用随机数字表随机分为假手术组.模型组和丹参组.参照人与动物体表面积换算公式[5],丹参组在术前连续7d用10mg/d剂量丹参提取液灌胃给药进行干预,模型组和假手术组给予腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液.1.4模型制备参照吉小微等[6]线栓法制备子宫缺血再灌注模型.造模前禁食不禁水,用体积分数为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/kg),起效后腹部向上固定于大鼠手术固定器,碘伏消毒,于耻骨联合上2cm处向上腹正中切开腹腔暴露子宫.然后从尾静脉注射50U/kg肝素,5min后翻出两侧腹壁组织,在子宫底处用5号丝线缝分别结扎两侧子宫,用玻璃分针钝性分离大鼠腹主动脉并用4号丝线结扎之,30min后去除两侧子宫和腹主动脉结扎线复灌.模型组手术同上,假手术组仅开腹不结扎,5min后关闭腹腔.1.5标本采集与检测参照文献[7]拟定,于干预前和造模后4h,3组各取6只大鼠,处死,分别取其子宫组织,-30℃低温冰箱暂存待测.1)IL-2.MDA.SOD和LDH浓度检测.分别取子宫组织研磨,匀浆,5000r/min离心10min,取上清液,严格按试剂盒步骤操作,用分光光度计检测子宫组织中IL-2.MDA.SOD和LDH浓度.2)Bcl-2和Bax蛋白阳性表达检测.采用免疫组织化学法,参照文献[8]提取Bcl-2和Bax蛋白,取暂存子宫标本,多聚甲醛固定24h,石蜡包埋.脱水.切片(厚约5μm).烤片,脱水后抗原修复,37℃孵育30min,PBS冲洗5min;滴加辣根过氧化物酶标记工作液,反应染色后冲洗,苏木精复染,脱水后封固.Bcl-2和Bax阳性为胞质及胞膜内侧出现黄至棕黄色颗粒,取5个高倍镜视野(400倍)计数每个高倍镜视野内的阳性细胞数和细胞总数,取平均值.1.6统计学处理应用SPSS19.0统计软件分析.计量资料以(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,用LSD检验显着性.P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1丹参提取液对大鼠子宫组织中IL-2和LDH的影响见表1.模型组干预后子宫组织IL-2和LDH含量均明显升高,与本组干预前和假手术组干预后同时期比较,差异有统计学意义(P<0.05).丹参组干预后IL-2含量降低,但仍高于假手术组,与模型组干预后比较,差异有统计学意义(P<0.05).2.2丹参提取液对大鼠子宫组织MDA和SOD的影响见表2.模型组干预后大鼠子宫组织MDA明显升高,SOD明显降低,与干预前和假手术组干预后比较,差异有统计学意义(P<0.05).与模型组干预后比较,丹参组MDA显着降低,SOD明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).2.3丹参提取液对大鼠子宫组织Bcl-2和Bax蛋白阳性表达的影响见表3.模型组干预后Bax蛋白阳性表达显着增强,Bcl-2降低,与干预前和假手术组干预后比较,差异有统计学意义(P<0.05).与模型组干预后比较,丹参组Bcl-2表达明显增强,Bax蛋白阳性表达有一定程度下调,差异有统计学意义(P<0.05).3讨论丹参性凉.味苦.归心.肝经,具有活血调经.消症化瘀.排脓消肿之功效,用于妇女症块.血瘀经闭.恶露.月经不调等顽疾[9].本草纲目谓丹参补新血,调经脉,心经邪火,令血调和,此其滋养而生血也”[10].现代药理研究发现,丹参提取液中富含水溶性丹参素和脂溶性丹参酮ⅡA等[11].亦有研究表明,钙超载是引起缺血再灌注损伤的根源,缺血再灌注时自由基大量生成,脂质过氧化促使膜的通透性增高,溶酶体膜损伤引起溶酶体释放,破坏细胞结构和功能造成线粒体功能障碍,故极时阻止脂质.观察发现,模型组缺血再灌注后子宫组织IL-2.MDA和LDH含量.Bax蛋白阳性表达显着增强,Bcl-2蛋白和SOD明显降低,提示缺血再灌注造成机体各种指标改变,造模方法可靠.丹参组干预后较模型组干预后大鼠子宫组织IL-2.MDA和LDH含量.Bax蛋白阳性表达下调,Bcl-2和SOD明显增高,提示丹参提取液具有明确的缺血再灌注保护作用.在本实验中,子宫组织复灌后,产生自由基会加剧脂质过氧化反应,生成有细胞毒性的产物MDA,加速生物膜的破坏.有研究发现,水溶性丹参素是超氧阴离子清除剂,与SOD的作用相似,可清除超氧阴离子,减少氧自由基的产生[12].另外,脂溶性丹参酮ⅡA可通过阻断羟自由基的合成并最终清除线粒体的脂质自由基[13].姚常柏等[14]研究发现丹参注射液对H-Fe体系中的羟自由基的清除率达65%,对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中的超氧阴离子的清除率达100%.IL-2作为炎症介质,在机体发生炎症反应时,主要起到诱导和激活T.B淋巴细胞的作用,IL-2增多时可增强中性粒细胞的溶酶体酶活性,增强由T.B淋巴细胞介导的细胞吞噬功能[15],故IL-2增多会造成过度炎症反应而加重组织细胞损伤.本实验中,丹参组大鼠在干预后IL-2明显降低,提示丹参提取液通过抑制T.B淋巴细胞分化,阻断IL-2介导激活T.B淋巴细胞介导的细胞吞噬功能,减少炎症细胞对缺血缺氧子宫浸润,达到避免或减少炎症反应加重的现象[16].缺血再灌注后子宫组织存在细胞凋亡现象,Bcl-2和Bax蛋白与凋亡调控直接相关,Bc1-2蛋白水平增高可抑制细胞凋亡,Bax蛋白水平增高会促进细胞凋亡.Bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白,在抗凋亡中发挥重要作用,可阻断因氧自由基.缺血缺氧等刺激引起的细胞凋亡[17].丹参组Bax表达降低.Bcl-2表达增高,这可能是丹参提取液中的脂溶性丹参酮ⅡA对子宫缺血再灌注损伤时,可能通过阻断羟自由基的合成并最终清除线粒体的脂质自由基[18],抑制细胞凋亡Bax蛋白,增高Bcl-2而抑制细胞凋亡,起到缺血再灌注损伤的保护作用.参考文献[1]王冬,吉小微,张爽,等.丹参酮ⅡA对子宫缺血再灌注损伤模型大鼠的保护效应[J].中国组织工程研究,2015,19(27)：4384-4388.[2]GaborS,SusanneB,NicoleS,etal.Poly-ADPribosepoly-meraseinhibitionreducesreperfusioninnryafterhearttrans-plantation[J].Transplatation,2002,90(2)：100-106.[3]王敬华,祁建青,尤莉芳,等.子宫内膜缺血在子宫内膜异位症中的作用及分子机制[J].生殖医学杂志,2015,24(6)：470-476.[4]杨志霞,林谦,马利,等.丹参对心血管疾病药理作用的文献研究[J].世界中西医结合杂志,2012,7(2)：93-96.[5]郑先科.机能实验科学[M].北京:北京大学医学出版社,2015:17-18.[6]吉小微,王冬,张爽,等.子宫缺血再灌注损伤模型建立[J].中国组织工程研究,2012,16(33)：6164-6168.[7]吕丽贤,张陈彦,安雪丽,等.磷酸肌酸对大鼠子宫缺血再灌注损伤的影响[J].解放军医药杂志,2015,27(5)：26-28.[8]王智慧,李仲平,梁海英,等.抗骨松汤对去卵巢骨质疏松大鼠细胞因子的影响[J].中国中医急症,2014,23(2)：254-255.[9]尚儒彪.中国武当医药秘方[M].北京:科学技术出版社,2002:68-69.[10]刘春慧.七情配伍理论的丹参药对临床用药规律研究[J].中医杂志,2016,57(2)：118-121.[11]马丙祥,董宠凯.丹参的药理作用研究新进展[J].中国药房,2014,25(7)：663-665.[12]杨宏杰,陈成川,郑敏,等.黄芪和丹参清除自由基能力的研究[J].复旦学报：自然科学版,2003,42(6)：935-938.[13]张铁,陈铁良.丹参对急性胰腺炎大鼠氧自由基水平的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2004,10(1)：34-36.[14]姚常柏,张丽红,于忠行,等.急性胰腺炎不同阶段应用丹参注射液对大鼠氧自由基变化的研究[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(11)：123-125.[15]吴修红,何录文,朴成玉,等.桂枝茯苓对子宫内膜异位症大鼠血清IL-2及IL-6的影响[J].中药材,2014,37(6)：1050-1053.[16]田淑霞,陈琚明,韩永龙,等.丹参酮对肺纤维化大鼠的干预作用及其机制研究[J].世界中医药,2014,9(12)：1647-1649.[17]XuWJ,ZhouR,WangLL,etal.Extractiontechnologyopti-mizationofhuoxuehuayugranules[J].ZhongYaoCai,2014,37(9)：1667-1672.[18]李光慧,戴维,李芳萍,等.丹参片和丹参注射液对多柔比星在大鼠体内药动学的影响[J].中国药房,2016,27(1)：67-69.

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