水稻维持磷稳态相关转录因子oswrkyp2互作蛋白的筛选与鉴定
1磷是影响植物生长发育的主要限制因子之一。而植物在漫长的进化过程当中，自身形成了一套适应缺磷环境的形态变化和生理生化机制。植物对土壤中缺磷环境的这些适应性机制都是由其背后一系列精巧的分子机制作为支撑的。根据目前已有的报道，WRKY家族转录因子主要在应对各种生物及非生物胁迫中发挥着重要的作用。本课题针对实验室目前已经获得磷相关转录因子OsWRKY-P2,通过酵母双杂建库筛选互作蛋白，并通过小规模酵母双杂实验进行验证。实验结果表明OsWRKY-P3转录因子与目的蛋白OsWRKY-P2的氨基酸序列有较高的同源性，并且在进化树上属于同一分支，酵母双杂小规模实验也验证了它们之间的互作关系，这将给后续实验奠定可靠的基础，同时有利于完善水稻磷信号网络通路。
目录
引言
磷是植物生长发育的必须大量元素之一，它是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成成分，同时还广泛参与了植物体内的能量代谢和信号转导过程[1]，因此可以认为磷素在植物生命过程中扮演着重要角色。植物对土壤中磷素的吸收主要是以无机磷（Pi）的形式[2]，然而由于磷极易被酸性土壤中的铁铝氧化物及石灰性土壤中的碳酸钙化合物固定，或是形成土壤有机物（将可溶性的磷转化为有机物质）使其成为植物难以吸收利用的固定态磷，因此大多数自然土壤中的有效磷很低，往往小于10μM[3]，这也常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一[4]。
如何缓解或解决土壤中可溶性磷含量不足，提高缺磷土壤中作物的生产力一直是土壤学科、植物营养学科、植物生理学科和遗传学科等研究工作者所普遍关注的问题。目前，国内外有许多关于植物响应低磷胁迫的研究。
磷胁迫下水稻为增强对磷的吸收，根系形态和根系结构上的适应性的变化构型发生改变，根冠比增加、侧根数量和根毛密度都会有所提高以增加根系表面积；根分泌物可以改变根际微生态系统中的物质循环，根系在缺磷情况下会分泌出有机酸、质子和酸性磷酸酶有机酸能够活化土壤中的FeP化合物和AlP化合物释放出游离的无机磷，根系分泌的质子使根际的pH降低随之有效磷的溶解度提高，酸性磷酸酶可以催化磷酸单脂分解成Pi和相应的脂肪酸，土壤中植物对缺磷环境的这些适应性机制都是由其背后一系列精巧的分子机制作为支撑的[57]。
近年来，该研究领域科学家们针对这些分子机 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
制做了大量的研究，初步构建了植物缺磷和低磷胁迫相应机制的分子调控网络。调控网络中一个基因在表达丰度或时间空间上的变化可能会造成整个网络的重新调整。水稻 Oryza sativa 是世界上重要的禾本科 Gramineae 粮食作物之一。据估计，到2030年，禾本科作物的产量至少需要提高40%才能满足人口增长所带来的粮食需求［8］所以挖掘和鉴定水稻磷素调控关键基因在创制优良水稻种质资源方面具有重要作用。
实验室的前期工作中，已经鉴定出了一个磷信号网络通路中的关键基因，本课题通过酵母建库，双杂技术筛选和鉴定与OsWRKYP2互作的蛋白，以期为水稻磷素信号调控网络分子机制的解析奠定工作基础。
1 材料与方法
1.1 诱饵表达载体构建
根据酵母表达载体pBDGAL4Cam 克隆位点及水稻锌指结构蛋白基因（OsWRKYP2）表达序列设计引物。以本实验室保存的水稻品种“日本晴 Nipponbare” 幼苗为试验材料，对幼苗cDNA进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。目的基因经双酶切回收后连接至酵母表达载体 pBDGAL4Cam 并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，重组酵母表达载体 pBDOsWRKYP2 双酶切验证后进行单克隆测序。
1.2 酵母双杂交诱蛋白自激活检测及转录因子转录激活结构域的鉴定
利用Clonetech酵母转化试剂盒，参照试剂盒步骤进行酵母转化。将诱饵载体pBDWT KYP2 和空载体pBDGAL4Cam分别转化酵母YRG2菌株。转化产物均划线于酵母氨基酸缺陷型培养基SD/－Trp、SD/－His培养基上，以SD/ Trp 为对照，30 ℃培养3d，观察平板上的菌斑生长情况以判断诱饵载体在酵母细胞中是否有自激活作用。
分别截取OsWRKYP2蛋白N端60、90、105、115个氨基酸，及C端20、45、90个氨基酸后，构建酵母诱饵表达载体,并分别命名为WRKYP2NΔ60、WRKYP2NΔ90、WRKYP2NΔ105、WRKYP2NΔ115、WRKYP2CΔ20、WRKYP2CΔ45、WRKYP2CΔ90。分别转化YRG2菌株，转化产物均划线于酵母氨基酸缺陷型培养基SD/－Trp、SD/－His培养基上，以SD/ Trp 为对照，30 ℃培养3d，进行转录激活结构域的验证。
1.3 酵母建库筛选互作蛋白
以上一步筛选出的pBDWRKYCΔ45为诱饵，送至德国公司做酵母建库双杂实验，筛选互作蛋白。
1.4 互作蛋白与目的蛋白序列比对及进化树分析
从公司给处的互作蛋白结果中，我们筛选出若干候选基因，其中存在一个与目的蛋白同家族的WRKY专利因子，我们暂时命名为OsWRKYP3,分别利用NCBI网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 。我们获得了该基因的序列，利用MEGA5.1软件我们分析互作基因OsWRKYP3、目的基因OsWRKYP2以及目前已经报道过的拟南芥AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75的氨基酸序列，并构建了进化树进行分析。
1.5 互作蛋白的回复验证
利用Clonetech酵母转化试剂盒，参照试剂盒步骤进行酵母转化。以OsWRKYP2CΔ45构建pBDGAL4Cam（原核抗性为Chl，酵母转化时用SDTrp进行筛选），以OsWRKYP3的ORF全场序列构建pADGAL42.1载体（原核抗性为Amp，酵母转化时用SDLeu进行筛选），共同转化YRG2菌株，在SD/－Trp、Leu固体培养基上进行筛选培养3d，将转化阳性克隆挑至SD/－Trp、Leu液体培养基中进行培养至OD=0.81.0，进行打点实验。
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引言
磷是植物生长发育的必须大量元素之一，它是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成成分，同时还广泛参与了植物体内的能量代谢和信号转导过程[1]，因此可以认为磷素在植物生命过程中扮演着重要角色。植物对土壤中磷素的吸收主要是以无机磷（Pi）的形式[2]，然而由于磷极易被酸性土壤中的铁铝氧化物及石灰性土壤中的碳酸钙化合物固定，或是形成土壤有机物（将可溶性的磷转化为有机物质）使其成为植物难以吸收利用的固定态磷，因此大多数自然土壤中的有效磷很低，往往小于10μM[3]，这也常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一[4]。
如何缓解或解决土壤中可溶性磷含量不足，提高缺磷土壤中作物的生产力一直是土壤学科、植物营养学科、植物生理学科和遗传学科等研究工作者所普遍关注的问题。目前，国内外有许多关于植物响应低磷胁迫的研究。
磷胁迫下水稻为增强对磷的吸收，根系形态和根系结构上的适应性的变化构型发生改变，根冠比增加、侧根数量和根毛密度都会有所提高以增加根系表面积；根分泌物可以改变根际微生态系统中的物质循环，根系在缺磷情况下会分泌出有机酸、质子和酸性磷酸酶有机酸能够活化土壤中的FeP化合物和AlP化合物释放出游离的无机磷，根系分泌的质子使根际的pH降低随之有效磷的溶解度提高，酸性磷酸酶可以催化磷酸单脂分解成Pi和相应的脂肪酸，土壤中植物对缺磷环境的这些适应性机制都是由其背后一系列精巧的分子机制作为支撑的[57]。
近年来，该研究领域科学家们针对这些分子机 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
制做了大量的研究，初步构建了植物缺磷和低磷胁迫相应机制的分子调控网络。调控网络中一个基因在表达丰度或时间空间上的变化可能会造成整个网络的重新调整。水稻 Oryza sativa 是世界上重要的禾本科 Gramineae 粮食作物之一。据估计，到2030年，禾本科作物的产量至少需要提高40%才能满足人口增长所带来的粮食需求［8］所以挖掘和鉴定水稻磷素调控关键基因在创制优良水稻种质资源方面具有重要作用。
实验室的前期工作中，已经鉴定出了一个磷信号网络通路中的关键基因，本课题通过酵母建库，双杂技术筛选和鉴定与OsWRKYP2互作的蛋白，以期为水稻磷素信号调控网络分子机制的解析奠定工作基础。
1 材料与方法
1.1 诱饵表达载体构建
根据酵母表达载体pBDGAL4Cam 克隆位点及水稻锌指结构蛋白基因（OsWRKYP2）表达序列设计引物。以本实验室保存的水稻品种“日本晴 Nipponbare” 幼苗为试验材料，对幼苗cDNA进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。目的基因经双酶切回收后连接至酵母表达载体 pBDGAL4Cam 并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，重组酵母表达载体 pBDOsWRKYP2 双酶切验证后进行单克隆测序。
1.2 酵母双杂交诱蛋白自激活检测及转录因子转录激活结构域的鉴定
利用Clonetech酵母转化试剂盒，参照试剂盒步骤进行酵母转化。将诱饵载体pBDWT KYP2 和空载体pBDGAL4Cam分别转化酵母YRG2菌株。转化产物均划线于酵母氨基酸缺陷型培养基SD/－Trp、SD/－His培养基上，以SD/ Trp 为对照，30 ℃培养3d，观察平板上的菌斑生长情况以判断诱饵载体在酵母细胞中是否有自激活作用。
分别截取OsWRKYP2蛋白N端60、90、105、115个氨基酸，及C端20、45、90个氨基酸后，构建酵母诱饵表达载体,并分别命名为WRKYP2NΔ60、WRKYP2NΔ90、WRKYP2NΔ105、WRKYP2NΔ115、WRKYP2CΔ20、WRKYP2CΔ45、WRKYP2CΔ90。分别转化YRG2菌株，转化产物均划线于酵母氨基酸缺陷型培养基SD/－Trp、SD/－His培养基上，以SD/ Trp 为对照，30 ℃培养3d，进行转录激活结构域的验证。
1.3 酵母建库筛选互作蛋白
以上一步筛选出的pBDWRKYCΔ45为诱饵，送至德国公司做酵母建库双杂实验，筛选互作蛋白。
1.4 互作蛋白与目的蛋白序列比对及进化树分析
从公司给处的互作蛋白结果中，我们筛选出若干候选基因，其中存在一个与目的蛋白同家族的WRKY专利因子，我们暂时命名为OsWRKYP3,分别利用NCBI网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 。我们获得了该基因的序列，利用MEGA5.1软件我们分析互作基因OsWRKYP3、目的基因OsWRKYP2以及目前已经报道过的拟南芥AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75的氨基酸序列，并构建了进化树进行分析。
1.5 互作蛋白的回复验证
利用Clonetech酵母转化试剂盒，参照试剂盒步骤进行酵母转化。以OsWRKYP2CΔ45构建pBDGAL4Cam（原核抗性为Chl，酵母转化时用SDTrp进行筛选），以OsWRKYP3的ORF全场序列构建pADGAL42.1载体（原核抗性为Amp，酵母转化时用SDLeu进行筛选），共同转化YRG2菌株，在SD/－Trp、Leu固体培养基上进行筛选培养3d，将转化阳性克隆挑至SD/－Trp、Leu液体培养基中进行培养至OD=0.81.0，进行打点实验。
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