水稻花药特异表达磷酸盐转运蛋白ospht1;7的功能研究
水稻是我国最重要的粮食作物之一，磷(P)是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，研究水稻磷素营养的生理学及分子生物学机制，不仅具有重要理论研究价值，也具有重大的经济和社会意义。磷在水稻中的吸收和分配主要是通过磷转运蛋白进行的，目前水稻磷转运蛋白家族OsPHT1中大部分成员的功能已被明确定义，而OsPHT1;7(OsPT7; Os03g0136400)的功能有待进一步的研究。本文以水稻磷转运蛋白基因OsPT7为研究对象，以模式品种日本晴(Nipponbare)为材料，通过生物信息学、荧光定量PCR(Q-PCR)分析其表达特征，酵母异源表达系统证明其磷转运能力，通过CRISPR-Cas9技术敲除目的基因，获得转基因材料用以研究OsPht1;7(OsPT7)的功能。研究结果表明，OsPT7主要定位于水稻的花药中，且花药中的PHT1家族基因的表达量以OsPT7最高。酵母异源表达系统证明了OsPT7具有磷吸收能力。烟草瞬时表达系统初步显示OsPT7细胞水平定位在质膜上。OsPT7的突变体材料表现出结实率下降的表型，说明OsPT7对水稻花药的发育可能起到一定的作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言（或绪论）1
2材料与方法4
2.1材料 4
2.2方法 4
2.2.1生物信息学分析4
2.2.2总RNA的提取及反转录4
2.2.3 荧光定量PCR(QPCR)分析4
2.2.4烟草瞬时表达体系亚细胞定位分析4
2.2.5水稻转基因材料的创制4
2.2.6酵母突变体异源表达体系4
2.2.7水稻结实率的统计5
3结果与分析5
3.1 OsPT7的表达模式分析5
3.2 OsPT7亚细胞水平定位分析6
3.3 OsPT7在酵母突变株中的功能验证6
3.4 Ospt7突变体的结实率和表型7
4讨论 7
致谢8
参考文献8
水稻花药特异表达磷酸盐转运蛋白OsPHT1;7的功能研究
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
1 引言
1.1 磷素营养的重要性
水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物，是世界上近二分之一人口的主要粮食来源。磷（Pi）是高等植物如水稻的生长和发育所必需的最重要的元素之一。它也是重要分子的组成部分，如ATP，核酸和磷脂。它在能量转移，代谢调节和蛋白质活性调节中起着至关重要的作用[1,2]。水稻从土壤中吸收的磷素主要以无机磷（Pi）的形式存在，包括H2PO4、HPO42、PO43等，其中H2PO4最易被植物根系吸收，主要通过植物根系细胞膜上的磷酸盐转运蛋白吸收和运输到体内[3]。虽然土壤中的总磷含量很高,但是土壤中可以被植物吸收的有效磷含量非常低,通常低于10μmol/ L，这是因为土壤中的磷素大部分被土壤中的Fe3+、Al3+以及Ca2+等金属离子固定,或被吸附在土壤中 [4,5]。在酸性土壤中，H2PO4与铁，铝和锰反应，生成不溶性氧化物。在碱性土壤中，可溶性H2PO4与钙迅速反应形成不溶性化合物。肥料中的磷酸盐也是如此：当浓缩的过磷酸钙肥被添加到土壤时，高度可溶性磷酸一钙（CaH2PO4）4与碳酸钙（CaCO3）快速反应形成磷酸二钙，再与CaCO3反应形成三钙磷酸盐，经历进一步的反应变得更难以溶解（比新鲜磷酸三钙多1000倍）[6]。因此,土壤有效磷的供应成为植物生长发育的决定因素之一[5]。自上个世纪70年代培育出杂交水稻以来，我国水稻的单产和总产量都获得了巨大的提升，特别是近几年以袁隆平院士为首的超级杂交稻研究团队屡次打破水稻亩产的记录，使得我国在杂交水稻的研究领域始终处于世界领先地位。另一方面，化肥工业在我国的迅速发展，对于水稻产量的巨大提升也是至关重要的，但是随着化肥施用量的快速增长，水稻养分利用效率却在逐年下降。过量施用肥料的直接后果是养分利用效率的降低，矿产资源的过度开采和巨大浪费，更造成严重的环境污染(如磷肥的过量施用导致水体富营养化)。随着农业资源利用与环境保护矛盾的日益加剧，人们越来越重视研究和改良水稻磷素利用的遗传潜力，从根本上提高水稻对肥料的利用效率[7][8][9][10]。所以，研究植物磷素营养的生理学及分子生物学机制，为植物磷高效利用提供种质资源，开发高效磷作物品种的现代分子育种技术，不仅具有重要理论研究价值，同时也具有显着的经济效益和社会意义。
分子和遗传分析揭示了磷的主要机制吸收和利用及其与磷转运蛋白，监管机构，根结构，代谢适应，数量性状基因座，激素信号传导和mRNA。提高磷利用效率的能力需要从这些知识的转变分子机制和植物结构到实际的策略。这些可以包括：i）使用丛枝菌根真菌共生有效磷；ii）与合适的作物物种间作使磷在土壤中的活性增强；iii）组织特异性过度表达的同源基因有利于农艺学，磷高效品种育种和关键定量渗入特征位点可以提高磷利用效率。需要更多的努力来进一步剖析控制机制植物对磷的吸收和利用，并为植物提供新的见解以有效提高磷利用效率[6]。
传统的育种过程需要很长时间，而各种环境条件下的根系统的表型选择是极具挑战性的。目前的分子技术极大地促进了作物育种和基因渗入，然而，分子标记辅助育种一般需要7 10年时间，并且分子标记辅助选择所获得的成果很少，耐磷品种非常有限[11,12]。鉴于基本性质和潜在的跨物种磷吸收和代谢保持，同源性基因过度表达可能是一种调查低磷条件下分子调控的有效方法，并且可以培育磷胁迫耐受品种，时间少，比传统育种成功概率大[13]。事实上，转运蛋白过表达已被证明可以提高养分利用效率[14]。迄今为止，许多转基因技术已经为许多作物品种[1417]和同源基因过表达增强磷的获得和含量提供了技术，这表明同源基因在不同作物中的过表达不仅促进磷的获得，但也揭示了作物磷吸收的监管和信号机制。这些转运蛋白，转录因子，磷信号调节因子和调节途径的同源基因过表达可以重新定义它的生物功能，并且可以增加磷利用效率[6]。
尽管增强植物从土壤中摄取磷量是非常理想的，但必须注意定期补充从田里获取的营养物质维护以土壤肥力和防止土壤退化。然而大部分发展中国家对于肥料的投入仍处于一个较低的水平，所以增加植物对土壤磷的吸收会加快土壤中储存磷含量的减少，对于这些国家而言没有长期效益。这不利于总磷含量低的土壤进行农业生产，所以对于这些土壤，提高植物磷利用效率是十分必要的[18]。
1.2 植物对缺磷的应对机制
在植物内，大部分磷储存在液泡中。 但是，在磷饥饿期间，液泡中的磷酸盐流出量不足以平衡胞质磷酸盐浓度[19]。 在缺磷条件下，由于磷酸盐流出不足，细胞溶质磷酸盐浓度迅速下降，这触发植物适应性反应，促进磷获取和转运[6]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言（或绪论）1
2材料与方法4
2.1材料 4
2.2方法 4
2.2.1生物信息学分析4
2.2.2总RNA的提取及反转录4
2.2.3 荧光定量PCR(QPCR)分析4
2.2.4烟草瞬时表达体系亚细胞定位分析4
2.2.5水稻转基因材料的创制4
2.2.6酵母突变体异源表达体系4
2.2.7水稻结实率的统计5
3结果与分析5
3.1 OsPT7的表达模式分析5
3.2 OsPT7亚细胞水平定位分析6
3.3 OsPT7在酵母突变株中的功能验证6
3.4 Ospt7突变体的结实率和表型7
4讨论 7
致谢8
参考文献8
水稻花药特异表达磷酸盐转运蛋白OsPHT1;7的功能研究
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
1 引言
1.1 磷素营养的重要性
水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物，是世界上近二分之一人口的主要粮食来源。磷（Pi）是高等植物如水稻的生长和发育所必需的最重要的元素之一。它也是重要分子的组成部分，如ATP，核酸和磷脂。它在能量转移，代谢调节和蛋白质活性调节中起着至关重要的作用[1,2]。水稻从土壤中吸收的磷素主要以无机磷（Pi）的形式存在，包括H2PO4、HPO42、PO43等，其中H2PO4最易被植物根系吸收，主要通过植物根系细胞膜上的磷酸盐转运蛋白吸收和运输到体内[3]。虽然土壤中的总磷含量很高,但是土壤中可以被植物吸收的有效磷含量非常低,通常低于10μmol/ L，这是因为土壤中的磷素大部分被土壤中的Fe3+、Al3+以及Ca2+等金属离子固定,或被吸附在土壤中 [4,5]。在酸性土壤中，H2PO4与铁，铝和锰反应，生成不溶性氧化物。在碱性土壤中，可溶性H2PO4与钙迅速反应形成不溶性化合物。肥料中的磷酸盐也是如此：当浓缩的过磷酸钙肥被添加到土壤时，高度可溶性磷酸一钙（CaH2PO4）4与碳酸钙（CaCO3）快速反应形成磷酸二钙，再与CaCO3反应形成三钙磷酸盐，经历进一步的反应变得更难以溶解（比新鲜磷酸三钙多1000倍）[6]。因此,土壤有效磷的供应成为植物生长发育的决定因素之一[5]。自上个世纪70年代培育出杂交水稻以来，我国水稻的单产和总产量都获得了巨大的提升，特别是近几年以袁隆平院士为首的超级杂交稻研究团队屡次打破水稻亩产的记录，使得我国在杂交水稻的研究领域始终处于世界领先地位。另一方面，化肥工业在我国的迅速发展，对于水稻产量的巨大提升也是至关重要的，但是随着化肥施用量的快速增长，水稻养分利用效率却在逐年下降。过量施用肥料的直接后果是养分利用效率的降低，矿产资源的过度开采和巨大浪费，更造成严重的环境污染(如磷肥的过量施用导致水体富营养化)。随着农业资源利用与环境保护矛盾的日益加剧，人们越来越重视研究和改良水稻磷素利用的遗传潜力，从根本上提高水稻对肥料的利用效率[7][8][9][10]。所以，研究植物磷素营养的生理学及分子生物学机制，为植物磷高效利用提供种质资源，开发高效磷作物品种的现代分子育种技术，不仅具有重要理论研究价值，同时也具有显着的经济效益和社会意义。
分子和遗传分析揭示了磷的主要机制吸收和利用及其与磷转运蛋白，监管机构，根结构，代谢适应，数量性状基因座，激素信号传导和mRNA。提高磷利用效率的能力需要从这些知识的转变分子机制和植物结构到实际的策略。这些可以包括：i）使用丛枝菌根真菌共生有效磷；ii）与合适的作物物种间作使磷在土壤中的活性增强；iii）组织特异性过度表达的同源基因有利于农艺学，磷高效品种育种和关键定量渗入特征位点可以提高磷利用效率。需要更多的努力来进一步剖析控制机制植物对磷的吸收和利用，并为植物提供新的见解以有效提高磷利用效率[6]。
传统的育种过程需要很长时间，而各种环境条件下的根系统的表型选择是极具挑战性的。目前的分子技术极大地促进了作物育种和基因渗入，然而，分子标记辅助育种一般需要7 10年时间，并且分子标记辅助选择所获得的成果很少，耐磷品种非常有限[11,12]。鉴于基本性质和潜在的跨物种磷吸收和代谢保持，同源性基因过度表达可能是一种调查低磷条件下分子调控的有效方法，并且可以培育磷胁迫耐受品种，时间少，比传统育种成功概率大[13]。事实上，转运蛋白过表达已被证明可以提高养分利用效率[14]。迄今为止，许多转基因技术已经为许多作物品种[1417]和同源基因过表达增强磷的获得和含量提供了技术，这表明同源基因在不同作物中的过表达不仅促进磷的获得，但也揭示了作物磷吸收的监管和信号机制。这些转运蛋白，转录因子，磷信号调节因子和调节途径的同源基因过表达可以重新定义它的生物功能，并且可以增加磷利用效率[6]。
尽管增强植物从土壤中摄取磷量是非常理想的，但必须注意定期补充从田里获取的营养物质维护以土壤肥力和防止土壤退化。然而大部分发展中国家对于肥料的投入仍处于一个较低的水平，所以增加植物对土壤磷的吸收会加快土壤中储存磷含量的减少，对于这些国家而言没有长期效益。这不利于总磷含量低的土壤进行农业生产，所以对于这些土壤，提高植物磷利用效率是十分必要的[18]。
1.2 植物对缺磷的应对机制
在植物内，大部分磷储存在液泡中。 但是，在磷饥饿期间，液泡中的磷酸盐流出量不足以平衡胞质磷酸盐浓度[19]。 在缺磷条件下，由于磷酸盐流出不足，细胞溶质磷酸盐浓度迅速下降，这触发植物适应性反应，促进磷获取和转运[6]。
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