水稻转录因子oswrkyp1调控株型的机制研究
:近年来，科学家对植物株型的分子调控网络机制进行了很多研究，主要集中在激素对植物株型的影响，但鲜有关于WRKY转录因子在激素信号转导和合成调控中的作用的报道。为了解水稻WRKY转录因子的基因功能并完善水稻株型的分子调控机制，本研究通过转基因手段和RT-qPCR技术，对OsWRKY-P1的超表达植株、CRISPR突变体材料的分蘖、株高等田间表型进行了对比，并就该基因的表达模式、表达丰度进行了分析。结果显示，超表达株系叶片角度增大，种子变短，而CRISPR突变体材料的叶片角度相较WT没有显著差异，通过田间表型的观测及后期相关生理实验，可以间接推测出超表达株系在地上部油菜素类酯激素含量相对于正常株系显著增多。结果表明，OsWRKY-P1在转录水平上参与了激素的调节，且在地上部发挥作用，但其分子调节机制还需进一步实验研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2实验试剂2
1.2实验方法2
1.2.1诱变水稻材料准备2
1.2.2水稻遗传性状统计2
1.2.3植物DNA的提取2
1.2.4水稻总RNA的提取及QPCR3
2结果与分析3
2.1水稻田间表型及其结果统计3
2.2 OsWRKYP1组织定位分析4
2.3 OsWRKYP1表达模式分析4
2.4 水稻总RNA的提取及QPCR结果5
2.5 油菜素内酯抑制剂回补实验 6
3讨论7
3.1 WRKY家族转录因子的作用 7
3.2 油菜素内酯与植株叶片夹角7
3.3 相关实验的研究展望8
致谢8
参考文献9
附录一 水稻总RNA提取9
水稻转录因子OsWRKYP1调控株型的机制研究
农业资源与环境 王子晗
引言< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
br /> 引言
水稻作为最重要的谷物之一，养活了世界上绝大部分人口。我国作为世界上水稻种植面积最大的国家，水稻对我国的重要性不言而喻【1】，人口数量迅速增长，耕地面积减少，提高水稻的产量对于水稻育种来说至关重要，而叶片角度是决定水稻籽粒产量的重要性状，一直是水稻育种项目中考虑的重要因素【2】【3】。
植物株型的影响因素包括茎秆高度、分蘖数、分蘖角度、穗的形态和数量。理想的植物株型应该是较少的无效分蘖，每穗的种子更多，并且茎秆粗壮。叶片的直立角度，即叶片与垂直茎秆的倾角，是植物结构的关键因素，对作物产量而言是一个重要的性状。这是因为直立的叶片可以让叶子两面受光，使阳光投射到植物较低部位的光合作用器官中，进而提高植物的光合作用效率和氮储存能力，有利于密植，提高叶面积指数【4】【5】。
目前，国内外对调节水稻良好株型，提高水稻育种品质进行了许多研究。有几个基因已被证实影响这些水稻性状：DEP1控制穗大小【6】；GN1A和APO1可以提高水稻籽粒数量；GS3、GW2和qSW5调节籽粒的尺寸；FZP和LAX1控制每穗的分支数【7】【8】。对调控这些性状的基因进行鉴定有助于完善水稻生产的分子机制，良好水稻株型提高水稻产量。
对改善作物产量和导致高产的基因进行确定是粮食安全项目中的重要环节，OsSPL14是一种启动子结合蛋白基因。在生殖阶段，OsSPL14的超表达可以促进水稻的穗分枝，提高籽粒产量，并且在营养阶段控制植物分枝【9】。研究表明，OsSPL14不仅可以提高水稻产量，对其他粮食作物也同样适用。这对育种项目意义重大。
近年来，科学家对于激素对植物株型影响进行了很多研究，构建了植物株型分子调控网络。各类型基因在调控网络中都扮演了重要角色，转录因子基因更是起了关键的调控作用。
油菜素内酯（brassinosteroid, BR）是一种类固醇激素，它通过影响细胞扩张，根茎叶的发育来调节植物生长发育，甚至能间接影响某些植物的净光合速率来调控植物生长【10】，并且该激素对植物生长发育的调控路径与赤霉素、生长素等其它植物激素不同【11】。近年来的研究已知，BR的生物合成途径包括早期和晚期的C22氧化途径，以及早期和晚期的C6氧化途径，催化其合成的酶则大多是细胞色素P450蛋白家族【12】。同时，BR的信号传导研究迅速发展，但单子叶植物中的BR信号转导则知之甚少。但据报道，BR在调控水稻叶片角度和籽粒大小等方面起着重要作用。大多数丧失BR生物合成功能的突变体，如，d11都显示了直立叶片、短粒和矮化的表型；相反增强BR生物信号合成的突变体，如，DTL超表达等都表现了较大的叶角和较长的籽粒。除此之外，油菜素内酯还参与植物的抗逆反应，例如通过诱导水稻幼苗体内的活性氧保护酶系统来提高水稻对高温的耐受能力【13】【14】。
因此以水稻转录因子OsWRKYP1为研究对象，采用转基因等遗传改良技术，以油菜素内酯、生长素等激素为切入点，研究水稻中WRKY转录因子的基因功能，阐明转录因子OsWRKYP1和激素参与水稻株型的调控网络，完善水稻中株型的分子调控机制，培育光能高效利用的优质水稻品种具有重大意义。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 植物材料：
水稻：野生型为日本晴 (ssp. japonica cv. Nipponbare)； 已经获得以日本晴为遗传背景的OsWRKYP1过量表达植株和CRISPRCas9体系构建突变体纯合株系。超表达材料编号为：Ox1、Ox5、Ox57；突变体材料编号为：W120、W133、W158。
1.1.2 实验试剂
1.1.2.1 水稻种子发苗以及阳性鉴定试剂
(1) 水稻种子发苗 1/2 MS 培养基
(2) 水稻完全营养液
(3) GUS 染液
1.1.2.2 水稻总 RNA的提取试剂
植株总 RNA 应采用公司购进 Trizol、DEPC 水，RNase Free离心管、枪头等，反转录采用TAKARA试剂盒。
1.2实验方法
1.2.1水稻发苗及鉴定
（1）水稻成熟种子消毒：将水稻置于50mL离心管中,33% NaClO溶液浸泡45分钟，70%酒精消毒2分钟，无菌水清洗种子4~5遍后浸泡十分钟；
（2）将消毒后的种子置于1/2 MS培养基避光培养3d，催芽，露白后转移到培养室内培养；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2实验试剂2
1.2实验方法2
1.2.1诱变水稻材料准备2
1.2.2水稻遗传性状统计2
1.2.3植物DNA的提取2
1.2.4水稻总RNA的提取及QPCR3
2结果与分析3
2.1水稻田间表型及其结果统计3
2.2 OsWRKYP1组织定位分析4
2.3 OsWRKYP1表达模式分析4
2.4 水稻总RNA的提取及QPCR结果5
2.5 油菜素内酯抑制剂回补实验 6
3讨论7
3.1 WRKY家族转录因子的作用 7
3.2 油菜素内酯与植株叶片夹角7
3.3 相关实验的研究展望8
致谢8
参考文献9
附录一 水稻总RNA提取9
水稻转录因子OsWRKYP1调控株型的机制研究
农业资源与环境 王子晗
引言< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
br /> 引言
水稻作为最重要的谷物之一，养活了世界上绝大部分人口。我国作为世界上水稻种植面积最大的国家，水稻对我国的重要性不言而喻【1】，人口数量迅速增长，耕地面积减少，提高水稻的产量对于水稻育种来说至关重要，而叶片角度是决定水稻籽粒产量的重要性状，一直是水稻育种项目中考虑的重要因素【2】【3】。
植物株型的影响因素包括茎秆高度、分蘖数、分蘖角度、穗的形态和数量。理想的植物株型应该是较少的无效分蘖，每穗的种子更多，并且茎秆粗壮。叶片的直立角度，即叶片与垂直茎秆的倾角，是植物结构的关键因素，对作物产量而言是一个重要的性状。这是因为直立的叶片可以让叶子两面受光，使阳光投射到植物较低部位的光合作用器官中，进而提高植物的光合作用效率和氮储存能力，有利于密植，提高叶面积指数【4】【5】。
目前，国内外对调节水稻良好株型，提高水稻育种品质进行了许多研究。有几个基因已被证实影响这些水稻性状：DEP1控制穗大小【6】；GN1A和APO1可以提高水稻籽粒数量；GS3、GW2和qSW5调节籽粒的尺寸；FZP和LAX1控制每穗的分支数【7】【8】。对调控这些性状的基因进行鉴定有助于完善水稻生产的分子机制，良好水稻株型提高水稻产量。
对改善作物产量和导致高产的基因进行确定是粮食安全项目中的重要环节，OsSPL14是一种启动子结合蛋白基因。在生殖阶段，OsSPL14的超表达可以促进水稻的穗分枝，提高籽粒产量，并且在营养阶段控制植物分枝【9】。研究表明，OsSPL14不仅可以提高水稻产量，对其他粮食作物也同样适用。这对育种项目意义重大。
近年来，科学家对于激素对植物株型影响进行了很多研究，构建了植物株型分子调控网络。各类型基因在调控网络中都扮演了重要角色，转录因子基因更是起了关键的调控作用。
油菜素内酯（brassinosteroid, BR）是一种类固醇激素，它通过影响细胞扩张，根茎叶的发育来调节植物生长发育，甚至能间接影响某些植物的净光合速率来调控植物生长【10】，并且该激素对植物生长发育的调控路径与赤霉素、生长素等其它植物激素不同【11】。近年来的研究已知，BR的生物合成途径包括早期和晚期的C22氧化途径，以及早期和晚期的C6氧化途径，催化其合成的酶则大多是细胞色素P450蛋白家族【12】。同时，BR的信号传导研究迅速发展，但单子叶植物中的BR信号转导则知之甚少。但据报道，BR在调控水稻叶片角度和籽粒大小等方面起着重要作用。大多数丧失BR生物合成功能的突变体，如，d11都显示了直立叶片、短粒和矮化的表型；相反增强BR生物信号合成的突变体，如，DTL超表达等都表现了较大的叶角和较长的籽粒。除此之外，油菜素内酯还参与植物的抗逆反应，例如通过诱导水稻幼苗体内的活性氧保护酶系统来提高水稻对高温的耐受能力【13】【14】。
因此以水稻转录因子OsWRKYP1为研究对象，采用转基因等遗传改良技术，以油菜素内酯、生长素等激素为切入点，研究水稻中WRKY转录因子的基因功能，阐明转录因子OsWRKYP1和激素参与水稻株型的调控网络，完善水稻中株型的分子调控机制，培育光能高效利用的优质水稻品种具有重大意义。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 植物材料：
水稻：野生型为日本晴 (ssp. japonica cv. Nipponbare)； 已经获得以日本晴为遗传背景的OsWRKYP1过量表达植株和CRISPRCas9体系构建突变体纯合株系。超表达材料编号为：Ox1、Ox5、Ox57；突变体材料编号为：W120、W133、W158。
1.1.2 实验试剂
1.1.2.1 水稻种子发苗以及阳性鉴定试剂
(1) 水稻种子发苗 1/2 MS 培养基
(2) 水稻完全营养液
(3) GUS 染液
1.1.2.2 水稻总 RNA的提取试剂
植株总 RNA 应采用公司购进 Trizol、DEPC 水，RNase Free离心管、枪头等，反转录采用TAKARA试剂盒。
1.2实验方法
1.2.1水稻发苗及鉴定
（1）水稻成熟种子消毒：将水稻置于50mL离心管中,33% NaClO溶液浸泡45分钟，70%酒精消毒2分钟，无菌水清洗种子4~5遍后浸泡十分钟；
（2）将消毒后的种子置于1/2 MS培养基避光培养3d，催芽，露白后转移到培养室内培养；
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