丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞增殖的拮抗作用

0引言血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的迁移和增殖是动脉粥样硬化(athemsclerosis,AS)病变的发病基础,VSMC数量越多,越易引起动脉粥样硬化[1].从理论上分析,临床可用从促进VSMC凋亡.抑制其过度增殖方面来治疗AS.丹参酮ⅡA(tans 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com 
hinoneⅡA,TA)是从丹参中提取的有效成分,有抑制血管损伤后平滑肌细胞增殖的效用.本研究重点探讨丹参酮IIA对血管平滑肌细胞CyclinD1和CDK4的表达的影响.1材料与方法1.1实验材料兔VSMC细胞株购自北京大学基础医细胞培养中心.同型半胱氨酸(25g/瓶,纯度≥98%,批号:C-7352)购自Sigma公司.丹参酮ⅡA(20mg/瓶,批号:200619)购自中国药品生物制品鉴定所；鼠抗人CyclinD1单抗(1:100),兔抗人CDK4单抗(1:100)试剂均购自Santacruz.USA;所用仪器包括FACSCalibur流式细胞仪(BD.USA公司).209b型超净工作台.HeraC02细胞培养箱(德国GMBH).BH-NIC-B型倒置显微镜(日本OlympsuOptical).1.2实验方法.1.2.1细胞培养与实验分组.在37℃.5%CO2条件下,用100mg/L的链霉素与青霉素.PRMI-1640培养基培养兔VSMC,取处于生长期的第三代到第五代细胞用于实验.按1×108/L密度稀释后接种于96孔培养板,培养24h.将细胞分为HCY模型组.丹参酮ⅡA处理组和空白对照组,每组设6个复孔.HCY模型组.丹参酮ⅡA处理组均加入10-4mol/L同型半胱氨酸,培养24h后,丹参酮ⅡA组加入0.25mg/L的丹参酮ⅡA,培养48h.空白对照组不予处理.1.2.2细胞周期分析.取生长状态良好的细胞制备细胞悬液,1000r/min离心5min,取沉渣后用PBS洗涤2次,用预冷的70%乙醇固定,置于处4℃冰箱避光冷藏.800r/min离心10min,PBS清洗2次；重悬细胞于100unit/mLRNaseA的PBS缓冲液中,37℃下温浴30min;加碘化丙锭(PI)混匀,避光孵育30min.用流式细胞术(FCM)检测细胞周期中不同时相的细胞数.1.3检测指标.调整细胞浓度为1×106/mL个,取细胞悬液置于试管中,加入鼠抗人CyclinD1.兔抗人CDK4单抗100μL,室温孵育30min,PBS洗涤1次,500r/min离心5min,加入FITC-IgG,避光室温孵育30min,PBS1次,离心弃上清液后加入1mLPBS液,500目铜网过滤后上机检测CyclinD1.CDK4的表达,每份标本测定5000个细胞.1.4统计学方法.采用SPSS20.0软件包进行分析,VSMC增殖周期细胞数和CyclinD1.CDK4的表达等计量资料用(-χ-±s)表示,采用t检验.P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1丹参酮ⅡA对VSMC细胞增殖周期的影响.丹参酮ⅡA组和空白对照组各期细胞数比较无明显差异(P>0.05)；丹参酮ⅡA组G0/G1期细胞数明显高于HCY组,S期.G2/M期细胞数明显低于HCY组(P<0.05).见表1.2.2丹参酮ⅡA对VSMCCyclinD1.CDK4表达的影响.丹参酮ⅡA组细胞CyclinD1.CDK4表达均显着低于HCY组(P<0.05).见表2.3讨论动脉粥样硬化(AS)的发生发展和血管内皮细胞损伤.血管平滑肌细胞(VSMC)克隆增殖.血管壁脂质浸润.血栓形成及各种黏附分子介导的炎症反应等密切相关,血管内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化的首发因素[2],血管平滑肌细胞的增殖.吞噬脂质转变成泡沫细胞.形成粥样斑块是导致动脉粥样硬化发生发展的核心因素.因此,抑制.阻断血管平滑肌细胞的增殖.促其凋亡可有效防治动脉粥样硬化.在所有真核细胞中,细胞周期的各个环节的起始与进程均通过细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的共同调控作用[3],CyclinD1.CDK4均为重要的细胞周期蛋白调控基因,前者随细胞周期不同时相进行合成和降解,后者通过有序的磷酸化和去磷酸化来调节细胞增殖,二者控制着细胞的增生和凋亡[4].随着动脉粥样硬化研究的不断深入,有学者发现某些中药或其有效成分可通过阻断诱导动脉粥样硬化细胞的过度增殖,促进VSMC凋亡[5-6].丹参酮ⅡA是从丹参中提出出的脂溶性有效成分,具有降压.改善微循环.扩张冠状动脉.抑制血小板聚集.预防血管平滑肌细胞增殖等药理作用,多用于治疗心血管疾病[7].本文将丹参酮ⅡA应用于HCY诱导的VSMC研究中,结果表明,丹参酮ⅡA组G0/G1期细胞数增多,S期.G2/M期细胞数明显减少,提示丹参酮ⅡA可使VSMC阻滞于G1期,具有拮抗VSMC增殖的作用.丹参酮ⅡA组细胞CyclinD1.CDK4表达均显着低于HCY组,提示丹参酮ⅡA阻滞VSMC细胞周期的机制可能与CyclinD1及CDK4的低表达有关.本文研究的局限性在于缺乏对不同剂量丹参酮ⅡA的研究,今后将在实验过程中进一步探讨.参考文献[1]陈芳,王丽,沈晓君,等.丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞BIP和CHOP表达的影响[J].中国老年学杂志,2015,08:2175-2177.[2]侯旭奔,方浩,杜金童,等.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的临床研究进展[J].中国新药杂志,2011,20(14)：1280-1286.[3]GhatakSB,DhamechaPS,BhadadaSV,etal.Investigationofthepotentialeffectsofmetforminonatherothromboticriskfactorsinhyperlipidemicrats[J].EurJPharmacol.2011,659(2-3)：213-223.[4]康郑军,李伟,王坦,等.丹参酮ⅡA诱导PC-3细胞凋亡的细胞周期调控机制[J].中国老年学杂志,2014,17:4899-4900.[5]沈晓君,高爱社,关怀敏,等.丹参酮ⅡA对兔动脉粥样硬化病灶凋亡相关基因表达的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(01)：90-92.[6]付强,张妍,沈晓君,等.丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞内质网应激相关基因表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(14)：280-283.[7]杨征,邱敏.丹参酮ⅡA的心血管作用及机制研究进展[J].中国动脉粥样硬化杂志,2011,19(4)：372-374.

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