高粱sbwrky5基因克隆和功能初步分析
1高粱（Sorghum bicolor L.）具有抗旱，耐盐碱，生长快速，产量高等优良特性，其中含有蛋白质，淀粉等多种营养物质。磷元素是植物生长过程中极为重要的营养元素之一，参与了植物体内很多的生理生化反应，对植物体自身的发育有着重要影响。WRKY转录因子是近年来植物分子生物学的重要研究方向，其在植物损伤，衰老和新陈代谢代谢，生物及非生物胁迫中都起着重要的作用。本试验克隆了高粱有关低磷胁迫的WRKY因子，命名为SbWRKY5，研究其在植物低磷耐性中的功能。通过qRT-PCR对高粱低磷处理0天，2天，4天，8天，10天，12天，14天后，分析低磷胁迫下在高粱根部和地上部SbWRKY5的表达情况，发现SbWRKY5在高粱地上部和根部都有表达，相对集中于根部。对转基因拟南芥的表型进行验证，结果T1代拟南芥在喷完Basta后全部死亡，通过对相关文献的查阅，推测SbWRKY5可能会使植株致死。
目录
引言
1 引言
1.1 高粱的功能
高粱具有抗旱，耐盐碱，生长快速，产量高等优良特性，其中含有蛋白质，淀粉等多种营养成分。中国是世界上仅有的几个栽培高粱最早的国家之一，高粱食用时能补充人体日常所需的营养素，所以也能预防生活中的某些普通疾病[1]。当高粱由于适口性较差的原因，不能在多数家畜的日粮中大量使用，但由于抗逆性强于玉米，同时高粱的某些优质品种的代谢能几乎能达到玉米的水平，所以高粱依然是一种很好的能量饲料[2]。
1.2 WRKY基因家族
WRKY基因家族是只有植物体内才存在的转录因子，与植物日常生长发育和自身的抗逆性有很大的联系，通过WRKY基因家族编码的转录调控因子WRKY蛋白全部最少含有一段60个氨基酸左右的结构，称之为结构域。同时这种结构的N端，几乎每一个成员都具有WRKYGQK的七肽，所以简称为WRKY[3]。在WRKY和锌指结构域所具有的氨基酸序列和数目的基础上，可以将WRKY基因家族分为三个种类[4]。第Ⅰ类的WRKY蛋白具备两个锌指结构；第Ⅱ类WRKY蛋白具备一个锌指基序，第Ⅱ类WRKY蛋白还能够分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe五个亚类[5]；第Ⅲ类WRKY蛋白只具备一个WRKY结构域[6]。
1.2.1 WRKY在非生物逆境中的变化< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 当植物置身于某种非生物逆境，如干旱，营养物质不足和温度骤变等，植物体内相应的WRKY转录因子就会在表达模式或者活性等方面发生变化，导致不同的信号途径和调控网络发生改变[7]，这是一种植物体内面对逆境胁迫常用的调控方式。小麦中发现了15个WRKYs ，水稻中10个OsWRKYs表现出了当外界环境温度和PEG变化时的反应[8]。目前已有的试验数据展现出，多种逆境偶尔会调控同一种WRKY蛋白发生表达，进一步帮助植物度过逆境[9]。
1.2.2 WRKY在植物生长发育中的作用
WRKY转录因子在种子初期发育，植物后期衰老等多个不同阶段发挥着作用。首个被发现与植物衰老过程有相关性的WRKY转录因子是AtWRKY6，当植物进入衰老时期，体内的AtWRKY6表达量会渐渐上调，同时联系SAG12，SAG13等衰老基因的开始表达[10]。
同一WRKY转录因子在多种信号途径中都能够发挥功能。AtWRKY6在被发现参与到拟南芥抗病的同时，还发现在植物低磷逆境中发挥着功效。
1.2.3 WRKY转录因子在低磷胁迫下的表达特性：
AtWRKY75是第首个来自于拟南芥，且同时与植物缺少营养元素，能够促进根系生长的 WRKY家族成员，低磷逆境可以进一步促使AtWRKY75进行表达[11]。当AtWRKY75基因被消除后，植株对低磷胁迫的表现更加敏感，与磷元素合成或者转运相关的基因均出现了表达量下降的现象，对植株对磷的吸收产生阻碍；WRKY42与WRKY6是同系物，以改变PHO1与PHT1;1基因是否表达，不同程度的表达方式来影响拟南芥植株体内的磷元素含量，达到植物体内磷元素的平衡[12]。AtWRKY6影响拟南芥PHO1基因表达，影响植物体对磷元素的吸收[13]水稻中发现的OsWRKY74是这些年来受低磷胁迫影响相对严重的WRKY基因。研究发现，与野生型水稻相比，OsWRKYP74超表达的水稻植株在低磷条件下的生存能力要远远高于前者[14]。由此可见，WRKY转录因子能够参与调控植株对低磷逆境的响应。
1.3 研究目的及意义：
当前世界磷矿资源贮藏总量非常有限,磷矿不仅是一种不可再生资源,同时预测在将来60～90年,磷矿资源将会一直被消耗下去[16]，当世界磷矿资源的消耗达到极致，不仅仅会影响到世界资源的总储备量，还会进一步改变生态环境，威胁全球生物的繁衍和发展。因此提升土壤中磷元素的生物有效性，使作物能够对土壤有机磷进行吸收将是一种重要的生态循环方式，这一研究的进步能够有效帮助人类真正从根本上解决磷资源储备所带来的危机。WRKY基因家族是植物独有的转录因子，贯穿植物一生的生长发育和植物本身的抗逆性，近年来发现WRKY基因不仅影响了植物的生长发育过程，同时还调节了植物对外界胁迫的响应过程[17]。本研究从高粱中克隆出的WRKY基因SbWRKY5。进过之前的研究，发现是一种能够在低磷逆境中发生响应的基因，通过对SbWRKY5基因进行克隆，并对其在低磷胁迫下所表现出的功能进行研究，希望能够对高粱低磷响应机制的研究具有一定的指导作用[18]。
2 材料与方法
2.1 试验材料及处理
材料：高粱（由中国农业科学院作物研究所陆平研究员提供，编号12484）。
2.2 试剂与仪器
2.2.1 主要试剂
高保真酶、DNA标准分子量（DL 2,000）、Taq聚合酶、限制性内切酶（XhoⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ）、T4 DNA连接酶、pMD19T载体等；PCR产物纯化（OMEGA）、RNA提取试剂盒（DP419）、胶回收（OMEGA）试剂盒、ReverTran Ace? qPCR RT试剂盒等；卡那霉素（Kan）、庆大霉素（Gen）、利福平（Rif）、氨苄霉素（Amp）、乙酰丁香酮等；引物均由金斯瑞科技（南京）有限公司合成。
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引言
1 引言
1.1 高粱的功能
高粱具有抗旱，耐盐碱，生长快速，产量高等优良特性，其中含有蛋白质，淀粉等多种营养成分。中国是世界上仅有的几个栽培高粱最早的国家之一，高粱食用时能补充人体日常所需的营养素，所以也能预防生活中的某些普通疾病[1]。当高粱由于适口性较差的原因，不能在多数家畜的日粮中大量使用，但由于抗逆性强于玉米，同时高粱的某些优质品种的代谢能几乎能达到玉米的水平，所以高粱依然是一种很好的能量饲料[2]。
1.2 WRKY基因家族
WRKY基因家族是只有植物体内才存在的转录因子，与植物日常生长发育和自身的抗逆性有很大的联系，通过WRKY基因家族编码的转录调控因子WRKY蛋白全部最少含有一段60个氨基酸左右的结构，称之为结构域。同时这种结构的N端，几乎每一个成员都具有WRKYGQK的七肽，所以简称为WRKY[3]。在WRKY和锌指结构域所具有的氨基酸序列和数目的基础上，可以将WRKY基因家族分为三个种类[4]。第Ⅰ类的WRKY蛋白具备两个锌指结构；第Ⅱ类WRKY蛋白具备一个锌指基序，第Ⅱ类WRKY蛋白还能够分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe五个亚类[5]；第Ⅲ类WRKY蛋白只具备一个WRKY结构域[6]。
1.2.1 WRKY在非生物逆境中的变化< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 当植物置身于某种非生物逆境，如干旱，营养物质不足和温度骤变等，植物体内相应的WRKY转录因子就会在表达模式或者活性等方面发生变化，导致不同的信号途径和调控网络发生改变[7]，这是一种植物体内面对逆境胁迫常用的调控方式。小麦中发现了15个WRKYs ，水稻中10个OsWRKYs表现出了当外界环境温度和PEG变化时的反应[8]。目前已有的试验数据展现出，多种逆境偶尔会调控同一种WRKY蛋白发生表达，进一步帮助植物度过逆境[9]。
1.2.2 WRKY在植物生长发育中的作用
WRKY转录因子在种子初期发育，植物后期衰老等多个不同阶段发挥着作用。首个被发现与植物衰老过程有相关性的WRKY转录因子是AtWRKY6，当植物进入衰老时期，体内的AtWRKY6表达量会渐渐上调，同时联系SAG12，SAG13等衰老基因的开始表达[10]。
同一WRKY转录因子在多种信号途径中都能够发挥功能。AtWRKY6在被发现参与到拟南芥抗病的同时，还发现在植物低磷逆境中发挥着功效。
1.2.3 WRKY转录因子在低磷胁迫下的表达特性：
AtWRKY75是第首个来自于拟南芥，且同时与植物缺少营养元素，能够促进根系生长的 WRKY家族成员，低磷逆境可以进一步促使AtWRKY75进行表达[11]。当AtWRKY75基因被消除后，植株对低磷胁迫的表现更加敏感，与磷元素合成或者转运相关的基因均出现了表达量下降的现象，对植株对磷的吸收产生阻碍；WRKY42与WRKY6是同系物，以改变PHO1与PHT1;1基因是否表达，不同程度的表达方式来影响拟南芥植株体内的磷元素含量，达到植物体内磷元素的平衡[12]。AtWRKY6影响拟南芥PHO1基因表达，影响植物体对磷元素的吸收[13]水稻中发现的OsWRKY74是这些年来受低磷胁迫影响相对严重的WRKY基因。研究发现，与野生型水稻相比，OsWRKYP74超表达的水稻植株在低磷条件下的生存能力要远远高于前者[14]。由此可见，WRKY转录因子能够参与调控植株对低磷逆境的响应。
1.3 研究目的及意义：
当前世界磷矿资源贮藏总量非常有限,磷矿不仅是一种不可再生资源,同时预测在将来60～90年,磷矿资源将会一直被消耗下去[16]，当世界磷矿资源的消耗达到极致，不仅仅会影响到世界资源的总储备量，还会进一步改变生态环境，威胁全球生物的繁衍和发展。因此提升土壤中磷元素的生物有效性，使作物能够对土壤有机磷进行吸收将是一种重要的生态循环方式，这一研究的进步能够有效帮助人类真正从根本上解决磷资源储备所带来的危机。WRKY基因家族是植物独有的转录因子，贯穿植物一生的生长发育和植物本身的抗逆性，近年来发现WRKY基因不仅影响了植物的生长发育过程，同时还调节了植物对外界胁迫的响应过程[17]。本研究从高粱中克隆出的WRKY基因SbWRKY5。进过之前的研究，发现是一种能够在低磷逆境中发生响应的基因，通过对SbWRKY5基因进行克隆，并对其在低磷胁迫下所表现出的功能进行研究，希望能够对高粱低磷响应机制的研究具有一定的指导作用[18]。
2 材料与方法
2.1 试验材料及处理
材料：高粱（由中国农业科学院作物研究所陆平研究员提供，编号12484）。
2.2 试剂与仪器
2.2.1 主要试剂
高保真酶、DNA标准分子量（DL 2,000）、Taq聚合酶、限制性内切酶（XhoⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ）、T4 DNA连接酶、pMD19T载体等；PCR产物纯化（OMEGA）、RNA提取试剂盒（DP419）、胶回收（OMEGA）试剂盒、ReverTran Ace? qPCR RT试剂盒等；卡那霉素（Kan）、庆大霉素（Gen）、利福平（Rif）、氨苄霉素（Amp）、乙酰丁香酮等；引物均由金斯瑞科技（南京）有限公司合成。
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