海滨雀稗nac家族基因克隆与表达分析
3海滨雀稗是一种优异的暖季型草坪草，是公认的耐盐草坪草，是草坪草抗逆机理研究的理想材料。本研究根据GenBanK中海滨雀稗的转录组数据，检索到NAC家族的12个基因中间片段，并利用RACE技术克隆了海滨雀稗的12个基因的全长序列同时，利用qPCR技术，分析了12NAC家族基因在盐、干旱、低温、镉等非生物胁迫和币斑病病原菌入侵的情况下的表达的差异。结果表明PvNAC6和PvNAC33在海滨雀稗根和叶中均参与低温胁迫的应答，PvNAC16在海滨雀稗根和叶中均参与干旱胁迫和币斑病胁迫的应答，PvNAC1和PvNAC16在海滨雀稗根和叶中均参与盐和镉胁迫的应答，本研究结果为海滨雀稗抗逆性研究奠定了基础。
目录
引言
引言
NAC家族转录因子是指植物特有的部分，植物一般有两种结果，如对称同型二聚体结构和螺旋转角螺旋结构（郝伟，2016；Balazadeh，2010；孙利军，2012）。正常情况下是由多个氨基酸分成几个亚结构域，有的结构域保守性强，有的结构域保守性差（李伟，2012；魏世伟，2014），再一次证明不仅在小麦中，大部分NAC转录因子都可以增加植物在各种胁迫中的生存能力(Balazadeh，2010)。如研究发现南芥转录因子中的ATAF1基因功能丧失后，其他基因的表达量增强，而且植物 在干旱环境中的生存能力变得比以前强（Lu，2007）。但是也有研究发现，若南芥中大量地表达ATAF1基因会导致植株矮小、主根变短，但抗旱性提高（Wu，2009）。此外，有些基因过量表达，使控制植物根生长部分的基因激活，根的数目和生活能力都比以前提高不少（Pandurangaiah，2014） 。
综上所述：植物的抗旱性是通过气孔开闭相关基因的表达量增加或者减少，根部生长发育基因的表达能力的活性强弱以及两者间的协调性，决定植物是否可以在干旱环境中很好的生存（Wang，2013），有的植物可以大量的表达某些基因，从而促进侧根形成，
使其适应目前的环境，加强植物在Na等盐环境中的生存能力（Han，2015）。有人通过低温实验，证明了LOV1转录因子可以增加南芥在低温环境中的生存能力（Yoo，2007）。
在植物中敲除耐热胁迫的基因后，它不一定能在低温条件中生存，但肯定无法继续在热环境中生存（Sha *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
hnejatBushehri，2012）。所以，NAC家族的基因抗寒和热胁迫的能力主要靠相对应的基因表达能力。本文研究的植物海滨雀稗在镉胁迫条件下，对应的基因会产生应答反应，如果受到币斑病等生物胁迫，植物会产生抗病机制从而存活下来。从小麦中分离得到GRAB1和GRAB2两个NAC家族转录因子能通过与WDV的RepA蛋白结合，可以抑制WDV的DNA病毒的复制（Xie,1999）。在水稻中发现的ONAC122和ONAC131转录因子具有相对应的转录活性。当侵染稻瘟菌后，它们的表达被诱导，来抵抗胁迫（Sun,2013）。综上所述，海滨雀稗NAC家族的转录因子在相对应的胁迫中，会通过增加或者减少转录因子的表达能力，形成新的表达模式，来适应逆环境。
1.材料与方法
1．1 试验材料
本实验选择海滨雀稗‘Sealsle 2000’为实验材料，开展海滨雀稗NAC家族部分基因全长序列的克隆，以及在盐、低温、干旱、镉和币斑病胁迫下的叶片和根系的表达分析。
1．2 试验方法
1．2．1 材料培养
剪取海滨雀稗具有两个节健壮的匍匐茎，将其固定在泡沫板，悬浮在1/2霍格兰营养液上进行培养，所需时间为3周。每1周更换一次营养液。材料达到实验要求后，进行以下处理：200 mM NaCl处理；20% PEG6000处理；4℃低温处理；300 μM CdCl2 处理以及喷施币斑病病原菌菌液处理。CdCl2处理、PEG6000处理、NaCl处理和币斑病原菌液处理光周期为白天/夜晚：15小时/9小时200 μmol m?2 s?1，温度为 30℃/25℃；低温处理时，光周期和其它处理一样，白天光照强度为50 μmol m?2 s?1。温度固定为4℃每个处理都进行3个重复，并且把0，1，3，12，24 小时剪取海滨雀稗的根系和叶片置于80℃保存。
1．2．2 海滨雀稗总RNA提取
利用OMEGA公司RNA试剂盒进行海滨雀稗叶片和根总RNA提取，并用M200酶标仪（Tecan）测定RNA的浓度和纯度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1．2．3 海滨雀稗NAC家族12个基因全长的克隆与生物信息学分析
根据NCBI( https://www.ncbi.nlm.ni h.gov/)已录入的海滨雀稗转录组数据分析筛选，共得到了21条NAC家族基因序列，最终选取12个基因，其中4个基因有全长序列，8个基因只有中间片段，利用Primer Primer 5.0软件设计8个基因的特异引物（见表1），采用RACE技术进行8个基因全长序列的克隆。另外，以提取的总RNA为模板，利用TaKaRa公司反转录试剂盒合成第一链cDNA。PCR反应程序为:
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
58℃ 30 sec 34cycles
72℃ 2 min
4℃ 保存。
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，利用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶纯化试剂盒进行回收，并将回收片段连入pMD?19T 载体(TAKARA)上转化大肠杆菌，随机挑取阳性克隆进行PCR鉴定，将阳性菌液送交南京思普金生物科技有限公司进行测序。 将测得序列与已获得的对应基因中间片段进行拼接，并进BLAST分析。最后将12个NAC家族基因全长序列进行系统进化分析。
表1 克隆8个NAC家族基因全长序列的引物
Table 1 primers for cloning 8 fulllength sequences of NAC family genes
引物
Primers
目录
引言
引言
NAC家族转录因子是指植物特有的部分，植物一般有两种结果，如对称同型二聚体结构和螺旋转角螺旋结构（郝伟，2016；Balazadeh，2010；孙利军，2012）。正常情况下是由多个氨基酸分成几个亚结构域，有的结构域保守性强，有的结构域保守性差（李伟，2012；魏世伟，2014），再一次证明不仅在小麦中，大部分NAC转录因子都可以增加植物在各种胁迫中的生存能力(Balazadeh，2010)。如研究发现南芥转录因子中的ATAF1基因功能丧失后，其他基因的表达量增强，而且植物 在干旱环境中的生存能力变得比以前强（Lu，2007）。但是也有研究发现，若南芥中大量地表达ATAF1基因会导致植株矮小、主根变短，但抗旱性提高（Wu，2009）。此外，有些基因过量表达，使控制植物根生长部分的基因激活，根的数目和生活能力都比以前提高不少（Pandurangaiah，2014） 。
综上所述：植物的抗旱性是通过气孔开闭相关基因的表达量增加或者减少，根部生长发育基因的表达能力的活性强弱以及两者间的协调性，决定植物是否可以在干旱环境中很好的生存（Wang，2013），有的植物可以大量的表达某些基因，从而促进侧根形成，
使其适应目前的环境，加强植物在Na等盐环境中的生存能力（Han，2015）。有人通过低温实验，证明了LOV1转录因子可以增加南芥在低温环境中的生存能力（Yoo，2007）。
在植物中敲除耐热胁迫的基因后，它不一定能在低温条件中生存，但肯定无法继续在热环境中生存（Sha *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
hnejatBushehri，2012）。所以，NAC家族的基因抗寒和热胁迫的能力主要靠相对应的基因表达能力。本文研究的植物海滨雀稗在镉胁迫条件下，对应的基因会产生应答反应，如果受到币斑病等生物胁迫，植物会产生抗病机制从而存活下来。从小麦中分离得到GRAB1和GRAB2两个NAC家族转录因子能通过与WDV的RepA蛋白结合，可以抑制WDV的DNA病毒的复制（Xie,1999）。在水稻中发现的ONAC122和ONAC131转录因子具有相对应的转录活性。当侵染稻瘟菌后，它们的表达被诱导，来抵抗胁迫（Sun,2013）。综上所述，海滨雀稗NAC家族的转录因子在相对应的胁迫中，会通过增加或者减少转录因子的表达能力，形成新的表达模式，来适应逆环境。
1.材料与方法
1．1 试验材料
本实验选择海滨雀稗‘Sealsle 2000’为实验材料，开展海滨雀稗NAC家族部分基因全长序列的克隆，以及在盐、低温、干旱、镉和币斑病胁迫下的叶片和根系的表达分析。
1．2 试验方法
1．2．1 材料培养
剪取海滨雀稗具有两个节健壮的匍匐茎，将其固定在泡沫板，悬浮在1/2霍格兰营养液上进行培养，所需时间为3周。每1周更换一次营养液。材料达到实验要求后，进行以下处理：200 mM NaCl处理；20% PEG6000处理；4℃低温处理；300 μM CdCl2 处理以及喷施币斑病病原菌菌液处理。CdCl2处理、PEG6000处理、NaCl处理和币斑病原菌液处理光周期为白天/夜晚：15小时/9小时200 μmol m?2 s?1，温度为 30℃/25℃；低温处理时，光周期和其它处理一样，白天光照强度为50 μmol m?2 s?1。温度固定为4℃每个处理都进行3个重复，并且把0，1，3，12，24 小时剪取海滨雀稗的根系和叶片置于80℃保存。
1．2．2 海滨雀稗总RNA提取
利用OMEGA公司RNA试剂盒进行海滨雀稗叶片和根总RNA提取，并用M200酶标仪（Tecan）测定RNA的浓度和纯度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1．2．3 海滨雀稗NAC家族12个基因全长的克隆与生物信息学分析
根据NCBI( https://www.ncbi.nlm.ni h.gov/)已录入的海滨雀稗转录组数据分析筛选，共得到了21条NAC家族基因序列，最终选取12个基因，其中4个基因有全长序列，8个基因只有中间片段，利用Primer Primer 5.0软件设计8个基因的特异引物（见表1），采用RACE技术进行8个基因全长序列的克隆。另外，以提取的总RNA为模板，利用TaKaRa公司反转录试剂盒合成第一链cDNA。PCR反应程序为:
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
58℃ 30 sec 34cycles
72℃ 2 min
4℃ 保存。
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，利用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶纯化试剂盒进行回收，并将回收片段连入pMD?19T 载体(TAKARA)上转化大肠杆菌，随机挑取阳性克隆进行PCR鉴定，将阳性菌液送交南京思普金生物科技有限公司进行测序。 将测得序列与已获得的对应基因中间片段进行拼接，并进BLAST分析。最后将12个NAC家族基因全长序列进行系统进化分析。
表1 克隆8个NAC家族基因全长序列的引物
Table 1 primers for cloning 8 fulllength sequences of NAC family genes
引物
Primers
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