非生物胁迫海滨雀稗内参基因的筛选
摘要：海滨雀稗（Paspalum vaginatum）是常用的暖季型草坪草之一，具有较强的抗逆性和广泛的适应性，已被广泛应用于滨海滩涂和盐碱地绿化中。也是研究暖季型草坪草非生物胁迫的优良材料，寻找海滨雀稗稳定表达的内参基因，对于提高海滨雀稗相关抗逆功能基因的表达分析和定量分析的准确性有着重要意义。本研究以海滨雀稗‘Seaspray’为研究对象，利用qRT-PCR技术，分别检测EF1A、CACS、GAPDH、TIP41、SAND、ACT、TUB、PP2A、FBOX、UBQ、CYP、U2AF 等12个候选内参基因在氯化镉、干旱、盐、低温四种非生物胁迫下的稳定性。利用Genorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等4个程序分析，其中，FBOX和U2AF在氯化镉胁迫时根部和叶片中、干旱胁迫和盐胁迫的根系中以及受低温胁迫的根系和叶片中表达稳定；在受干旱胁迫的叶片中，UPL和PP2A表达稳定性较高；能在受盐胁迫的叶片中稳定表达的内参基因为SAND、PP2A以及CACS。为海滨雀稗在不同胁迫条件下，选择适宜的内参基因进行基因表达定量研究提供了参考依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 3
1.2.1材料培养3
1.2.2总RNA提取和cDNA第一链合成3
1.2.3内参基因的选择和引物设计3
1.2.4内参基因片段的普通PCR扩增3
1.2.5内参基因的实时荧光定量PCR分析4
1.2.6数据处理与分析4
2 结果与分析4
2.1内参基因片段的qRTPCR扩增分析4
2.2扩增效率和扩增特异性分析6
2.3 内参基因Cq值、CV值分析7
2.4 内参基因表达稳定性分析 8
2.4.1 Genorm分析8
2.4.2 NormFinder分析9
2.4.3 BestKeeper分析11
2.4.4 RefFinder分析13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
> 3讨论 15
致谢15
参考文献16
非生物胁迫海滨雀稗内参基因的筛选
草业科学 赖慧
引言
引言
基因表达分析作为当代分子生物学研究的基本手段，有助于研究生物体生命代谢活动，更好的认识生物体在不同条件下的信号传导和代谢途径。实时荧光定量PCR（RealTime PCR，qRTPCR）作为检测基因表达的方法之一，具有灵敏度高、准确性高、特意识别性强以及高通量等特点，已被越来越多人使用。然而，RNA的质量和完整性、RNA反转录合成效率、扩增效率和分析方法等因素都会影响qRTPCR分析结果（Maroufi et al., 2010）。 其中，内参基因的稳定性直接决定了qRTPCR的准确性，为了消除不合理的内参基因给实验结果带来的误差，在植物基因相对定量分析前，选择适合的稳定表达的内参基因进行qRTPCR分析势在必行（Zhu et al. 2013）。而理想的内参基因应当在不同条件下都能稳定表达，且表达水平与目标基因相似。目前在植物学研究中，肌动蛋白（Actin）（Li 2005, Domoki et al. 2006），18S和25S rRNA（Jain et al. 2006），甘油醛3磷酸脱氢酶基因（GAPDH）（Sekalska et al. 2006），微管蛋白基因（TUB）（Jeong et al. 2006）等是常用的稳定表达的内参基因。但是，Zhu等研究表明，在不同的生理状态下、不同组织器官和不同实验处理条件下，传统内参基因表达存在显著差异（Zhu et al. 2013）。内参基因稳定性在qRTPCR分析中产生了不确定性。因此，根据不同环境和条件选择合适的内参基因已成为应用qRTPCR进行基因组功能分析的重要前提。近来有研究发现一些新的稳定基因，如Czechowski等从拟南芥中发现PP2A和TIP41这两个基因稳定性好（Czechowski et al. 2005），其中PP2A在西红柿（Solanum lycopersicum）里表达稳定（Lovdal and Lillo 2009）； TIP41在西红柿（Lovdal and Lillo 2009），杨树（Basa et al. 2009），棉花（Artico et al. 2010）和柠条（Caragana intermedia）（Zhu et al. 2013）中稳定性都较高。
海滨雀稗（Paspalum vaginatum）是禾本科（Gramineae）雀稗属（Paspalum）多年生草本植物，广泛分布在热带和亚热带地区。因其出色的耐盐能力和重金属适应能力，多用于改良盐碱地和重金属污染的土壤中。目前海滨雀稗内参基因的筛选尚未见相关报道。本研究围绕氯化镉、干旱、盐和低温四种非生物胁迫，筛选适宜海滨雀稗基因相对表达分析的内参基因，为进一步研究海滨雀稗和其他草坪草逆境胁迫下相关分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
本实验所用材料品种海滨雀稗（Paspalum vaginatum）‘Seaspray’来自大学草业学院草种质资源圃，对海滨雀稗分别在氯化镉、干旱、盐和低温胁迫下的叶片和根进行总RNA提取和实时荧光定量PCR分析。
1．2 试验方法
1．2．1 材料培养
剪取具有两个节生长良好的海滨雀稗匍匐茎，用海绵条固定在泡沫板上，并使其悬浮在霍格兰营养液上培养1521天，1/2的霍格兰营养液配方为2.5 mM Ca(NO3)2?4H2O, 2.5 mM KNO3, 1 mM MgSO4?7H2O, 0.5 mM KH2PO4, 46 μM H3BO3, 9 μM MnCl2?4H2O, 0.8 μM ZnSO4?7H2O, 0.1 μM H2MoO4?H2O, 0.3 μM CuSO4?5H2O, 和 20 μM FeEDTA。每57天更换一次营养液。待材料生长一致后，分别进行以下四种处理：300 mM NaCl盐处理；4℃低温处理；20% PEG 6000处理；1 mM CdCl2 氯化镉处理。其中，氯化镉处理、PEG处理和盐处理的光周期为白天/夜晚：14小时/10小时，白天光照强度为200 μmol m?2 s?1，夜晚无光照。白天的温度设置为30℃，晚上的温度设置为25℃，湿度保持为60%，二氧化碳浓度为400 ppm。低温处理时，光周期和其它处理一样，白天光照强度为50 μmol m?2 s?1，夜晚无光照。白天和夜晚温度均为4℃，湿度维持在60%，二氧化碳浓度为400 ppm。每个处理3个生物学重复，分别在处理0，1，3，6，12，24 小时剪取植物叶片和根系，迅速液氮保存提取植物总RNA进行RTPCR定量分析。
1．2．2 总RNA提取和cDNA第一链合成
采用E.Z.N.A.? Total RNA Kit I（OMEGA）提取海滨雀稗的叶片和根系的总RNA。提取后，分别用酶标仪（M200, Tecan, CHE）测定RNA的浓度和纯度，用1%的琼脂凝胶电泳检测RNA质量，并将符合要求的总RNA于80℃保存备用。根据RNA浓度吸取0.5 μg的总RNA量依照TaKaRa产品PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser ( TaKaRa, Otsu, Japan ) 进行cDNA第一链的合成。反转录完成后，按1：10用超纯水稀释cDNA，用以qRTPCR分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 3
1.2.1材料培养3
1.2.2总RNA提取和cDNA第一链合成3
1.2.3内参基因的选择和引物设计3
1.2.4内参基因片段的普通PCR扩增3
1.2.5内参基因的实时荧光定量PCR分析4
1.2.6数据处理与分析4
2 结果与分析4
2.1内参基因片段的qRTPCR扩增分析4
2.2扩增效率和扩增特异性分析6
2.3 内参基因Cq值、CV值分析7
2.4 内参基因表达稳定性分析 8
2.4.1 Genorm分析8
2.4.2 NormFinder分析9
2.4.3 BestKeeper分析11
2.4.4 RefFinder分析13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
> 3讨论 15
致谢15
参考文献16
非生物胁迫海滨雀稗内参基因的筛选
草业科学 赖慧
引言
引言
基因表达分析作为当代分子生物学研究的基本手段，有助于研究生物体生命代谢活动，更好的认识生物体在不同条件下的信号传导和代谢途径。实时荧光定量PCR（RealTime PCR，qRTPCR）作为检测基因表达的方法之一，具有灵敏度高、准确性高、特意识别性强以及高通量等特点，已被越来越多人使用。然而，RNA的质量和完整性、RNA反转录合成效率、扩增效率和分析方法等因素都会影响qRTPCR分析结果（Maroufi et al., 2010）。 其中，内参基因的稳定性直接决定了qRTPCR的准确性，为了消除不合理的内参基因给实验结果带来的误差，在植物基因相对定量分析前，选择适合的稳定表达的内参基因进行qRTPCR分析势在必行（Zhu et al. 2013）。而理想的内参基因应当在不同条件下都能稳定表达，且表达水平与目标基因相似。目前在植物学研究中，肌动蛋白（Actin）（Li 2005, Domoki et al. 2006），18S和25S rRNA（Jain et al. 2006），甘油醛3磷酸脱氢酶基因（GAPDH）（Sekalska et al. 2006），微管蛋白基因（TUB）（Jeong et al. 2006）等是常用的稳定表达的内参基因。但是，Zhu等研究表明，在不同的生理状态下、不同组织器官和不同实验处理条件下，传统内参基因表达存在显著差异（Zhu et al. 2013）。内参基因稳定性在qRTPCR分析中产生了不确定性。因此，根据不同环境和条件选择合适的内参基因已成为应用qRTPCR进行基因组功能分析的重要前提。近来有研究发现一些新的稳定基因，如Czechowski等从拟南芥中发现PP2A和TIP41这两个基因稳定性好（Czechowski et al. 2005），其中PP2A在西红柿（Solanum lycopersicum）里表达稳定（Lovdal and Lillo 2009）； TIP41在西红柿（Lovdal and Lillo 2009），杨树（Basa et al. 2009），棉花（Artico et al. 2010）和柠条（Caragana intermedia）（Zhu et al. 2013）中稳定性都较高。
海滨雀稗（Paspalum vaginatum）是禾本科（Gramineae）雀稗属（Paspalum）多年生草本植物，广泛分布在热带和亚热带地区。因其出色的耐盐能力和重金属适应能力，多用于改良盐碱地和重金属污染的土壤中。目前海滨雀稗内参基因的筛选尚未见相关报道。本研究围绕氯化镉、干旱、盐和低温四种非生物胁迫，筛选适宜海滨雀稗基因相对表达分析的内参基因，为进一步研究海滨雀稗和其他草坪草逆境胁迫下相关分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
本实验所用材料品种海滨雀稗（Paspalum vaginatum）‘Seaspray’来自大学草业学院草种质资源圃，对海滨雀稗分别在氯化镉、干旱、盐和低温胁迫下的叶片和根进行总RNA提取和实时荧光定量PCR分析。
1．2 试验方法
1．2．1 材料培养
剪取具有两个节生长良好的海滨雀稗匍匐茎，用海绵条固定在泡沫板上，并使其悬浮在霍格兰营养液上培养1521天，1/2的霍格兰营养液配方为2.5 mM Ca(NO3)2?4H2O, 2.5 mM KNO3, 1 mM MgSO4?7H2O, 0.5 mM KH2PO4, 46 μM H3BO3, 9 μM MnCl2?4H2O, 0.8 μM ZnSO4?7H2O, 0.1 μM H2MoO4?H2O, 0.3 μM CuSO4?5H2O, 和 20 μM FeEDTA。每57天更换一次营养液。待材料生长一致后，分别进行以下四种处理：300 mM NaCl盐处理；4℃低温处理；20% PEG 6000处理；1 mM CdCl2 氯化镉处理。其中，氯化镉处理、PEG处理和盐处理的光周期为白天/夜晚：14小时/10小时，白天光照强度为200 μmol m?2 s?1，夜晚无光照。白天的温度设置为30℃，晚上的温度设置为25℃，湿度保持为60%，二氧化碳浓度为400 ppm。低温处理时，光周期和其它处理一样，白天光照强度为50 μmol m?2 s?1，夜晚无光照。白天和夜晚温度均为4℃，湿度维持在60%，二氧化碳浓度为400 ppm。每个处理3个生物学重复，分别在处理0，1，3，6，12，24 小时剪取植物叶片和根系，迅速液氮保存提取植物总RNA进行RTPCR定量分析。
1．2．2 总RNA提取和cDNA第一链合成
采用E.Z.N.A.? Total RNA Kit I（OMEGA）提取海滨雀稗的叶片和根系的总RNA。提取后，分别用酶标仪（M200, Tecan, CHE）测定RNA的浓度和纯度，用1%的琼脂凝胶电泳检测RNA质量，并将符合要求的总RNA于80℃保存备用。根据RNA浓度吸取0.5 μg的总RNA量依照TaKaRa产品PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser ( TaKaRa, Otsu, Japan ) 进行cDNA第一链的合成。反转录完成后，按1：10用超纯水稀释cDNA，用以qRTPCR分析。
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