黑麦草sgr与叶绿素代谢相关蛋白（nol，nyc1，pph）互作研究
摘要：饲草收获后叶绿素降解加速，蛋白质流失，饲草品质下降。阻抑叶绿素降解能够延长饲草采后绿期，提高蛋白质含量，提高饲草品质。拟南芥叶片衰老相关基因SGR 在叶绿素代谢过程中占据着核心调控地位，SGR能够与叶绿素代谢酶以及光捕获系统复合体 II蛋白互作。本试验采用异源酵母双杂交系统和内源双分子互补系统两种系统，验证CCEs（NOL,NYC1，PPH）与SGR间互作。前者没有检测到信号，可能与其功能定位于类囊体膜有关。而后者证实SGR与黑麦草叶绿素代谢相关蛋白CCEs间原生质体体内均存在互作。这一结果验证了黑麦草叶绿素降解途径相关蛋白互作与拟南芥中的发现相似，存在高度保守性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1原生质体分离3
1.2.2原生质体转化3
1.2.3激光共聚焦检测3
1.2.4载体构建与验证3
1.2.5酵母感受态制备3
1.2.6载体构建与验证3
1.2.7 酵母感受态转化与培养4
1.2.8 酵母阳性细胞鉴定与互作验证4
2结果与分析4
2.1载体构建与验证4
2.2原生质体的制备4
2.3原生质体的转化与激光共聚焦检测5
2.4酵母双杂交系统载体构建与验证5
2.5酵母细胞转化与互作验证6
3讨论7
3.1 SGR不具有酶活性，但在叶绿素降解过程中占据核心调控地位7
3.2 SGR与其它CCEs间有无互作还需进一步研究证实...7
致谢.8
参考文献8
图1 重组载体大小凝胶电泳检测3
图2 重组载体酶切产物电泳检测3
图3 黑麦草原生质体活性检测4
图4 重组载体酶切产物电泳检测4
图 5 酵母双杂交载体构建与验证.6
图 6 酵母双杂交筛选.7
黑麦草SGR与叶绿
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
素代谢相关蛋白（NOL,NYC1,PPH）互作研究
引言
在农牧业和草坪草生产中，青绿色是优质饲用干草和草坪草的重要外观特征和评价指标。阻抑叶绿素降解能够提高干物质粗蛋白质含量，进而提高饲草品质。有报道指出通过抑制STAYGREEN基因（SGR）表达不但可以使衰老叶片或收获后的叶片持绿时间延长，而且可以提高收获后的干物质蛋白含量。
前人研究结果指出，叶绿素降解首先经两步酶促反应由叶绿素b降解为叶绿素a:叶绿素b还原酶NOL和NYC1；羟甲基叶绿素a还原酶HCAR。羟甲基叶绿素a经过脱镁开始进入叶绿素降解，依次经过脱植醇（PPH）和开环(PAO)形成红色叶绿素代谢产物（RCC），最后经红色叶绿素代谢产物还原酶（RCCR）还原成非荧光叶绿素代谢产物(pFCC)，进入液泡。
滞绿基因蛋白SGR参与叶绿素代谢，不具有酶促活性，但却能够直接或间接与其它五种功能酶基因特异地在LHCII上互作。由此可见，STAYGREEN(SGR)在叶绿素代谢过程中占据着核心调控地位（“master” regulator）[1,2]。目前，关于SGR已知基因与叶绿素代谢相关蛋白互作的研究多见于拟南芥和水稻等模式植物和重要粮食作物中。拟南芥中包括三个SGR同源基因，分别为SGR1[也称为NYE1或NOC1]，SGR2和 SGRLIKE (SGRL)，它们在叶绿素降解中起着不同的作用[3]。在这三个SGR同源基因中，SGR1研究最多，结果表明自然衰老和暗诱导衰老条件下，拟南芥nye11 / sgr11突变体表现出持绿性状,而SGR1OX植物则表现出叶片提前衰老[4,5]。同时，非生物和生物胁迫下，nye11 / sgr11和noc11 / sgr12突变体在营养生长阶段[6,7]和种子成熟阶段[8]叶片持绿期较WT长,这表明在植物的生长发育中，SGR1在激活叶绿素降解方面起重要作用。 目前研究可知，与SGR已知基因互作的叶绿素代谢相关蛋白有NYC1、NOL、PPH等。
截止目前，叶绿素降解通路蛋白（CCEs）已鉴定出六个：Nonyellowing coloring1?(NYC1) [9,10] 、NYC1Like(NOL) [11] 、?7Hydroxymethyl chlorophyll a reductase(HCAR)[12]、Pheophytin pheophorbide hydrolase?(PPH) [13,14]、Pheophorbide a oxygenase?(PAO) [15,16] 、Red chlorophyll catabolite reductase?(RCCR) [17] 。并且，关于黑暗诱导衰老条件下SGR1和CCEs功能研究已在模式植物中取得较大进展[5,10,12,14,15,18]，Park等研究指出SGR1能够与光捕获系统II（LHCII）在体内结合[18] 。Sakuraba等研究指出拟南芥SGR1能够直接与其它六个CCEs 互作，并且它们只能特异地结合到LHCII上，从而形成LHCIISGR1CCEs动态复合体参与叶绿素的降解，并在未衰老组织中具有解毒功能。关于叶绿素中间产物代谢基因功能已在拟南芥[15,17,19,20] ，水稻[21]和玉米[22,23]中有所研究。至此，Sakuraba等总结前人研究成果并给出了一张SGR1与CCEs间作用机制图。
但是截至目前，关于单子叶植物尤其多年生牧草或草坪草（如黑麦草）中SGR1与CCEs间作用机制研究较少，现有报道仅通过体内和体外试验证实水稻NOL和NYC1间存在直接互作[11,13]，那么，其它CCEs间存在什么样的规律目前尚不清楚。
多年生黑麦草（Lolium perenne L.），属于禾本科早熟禾亚科黑麦草属（Lolium L.）植物，是温带地区重要的牧草和草坪草[24,25] ，多为二倍体[26]，目前基因组草图已经完成[27]，而且其遗传转化体系成熟[28]，故而黑麦草可作为研究多年生冷季型牧草和草坪草叶片衰老机制的模型。
酵母双杂交系统是筛选互作蛋白的重要方法，国内外都有很广泛的应用，在动植物病理学、免疫学、育种学等研究方面有着很重要的作用。Sakuraba[5]等利用酵母双杂交系统成功鉴定SGR和CCEs间互作。植物原生质体是指植物细胞去除细胞壁后剩余的完整结构体，首次经Cocking报道，它能够提供一个方便的细胞水平试验模型。通过适宜的转化方法，生物大分子比如DNA，RNA以及蛋白质均能转化进入原生质体中，从而探究其功能[29,30]。自从Sheen实验室报道拟南芥瞬时转化（TEAMP）法[31]以来，原生质体瞬时转化已迅速普及到拟南芥[29,31]，玉米[29]，烟草[32], 水稻[33,34], 洋葱表皮细胞[35,36]，杨树[37,38]，等等[39,40]。 目前这种方法已广泛应用于基因表达，蛋白亚细胞定位，蛋白与蛋白互作以及蛋白活性检测等研究中[29,38]。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1原生质体分离3
1.2.2原生质体转化3
1.2.3激光共聚焦检测3
1.2.4载体构建与验证3
1.2.5酵母感受态制备3
1.2.6载体构建与验证3
1.2.7 酵母感受态转化与培养4
1.2.8 酵母阳性细胞鉴定与互作验证4
2结果与分析4
2.1载体构建与验证4
2.2原生质体的制备4
2.3原生质体的转化与激光共聚焦检测5
2.4酵母双杂交系统载体构建与验证5
2.5酵母细胞转化与互作验证6
3讨论7
3.1 SGR不具有酶活性，但在叶绿素降解过程中占据核心调控地位7
3.2 SGR与其它CCEs间有无互作还需进一步研究证实...7
致谢.8
参考文献8
图1 重组载体大小凝胶电泳检测3
图2 重组载体酶切产物电泳检测3
图3 黑麦草原生质体活性检测4
图4 重组载体酶切产物电泳检测4
图 5 酵母双杂交载体构建与验证.6
图 6 酵母双杂交筛选.7
黑麦草SGR与叶绿
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
素代谢相关蛋白（NOL,NYC1,PPH）互作研究
引言
在农牧业和草坪草生产中，青绿色是优质饲用干草和草坪草的重要外观特征和评价指标。阻抑叶绿素降解能够提高干物质粗蛋白质含量，进而提高饲草品质。有报道指出通过抑制STAYGREEN基因（SGR）表达不但可以使衰老叶片或收获后的叶片持绿时间延长，而且可以提高收获后的干物质蛋白含量。
前人研究结果指出，叶绿素降解首先经两步酶促反应由叶绿素b降解为叶绿素a:叶绿素b还原酶NOL和NYC1；羟甲基叶绿素a还原酶HCAR。羟甲基叶绿素a经过脱镁开始进入叶绿素降解，依次经过脱植醇（PPH）和开环(PAO)形成红色叶绿素代谢产物（RCC），最后经红色叶绿素代谢产物还原酶（RCCR）还原成非荧光叶绿素代谢产物(pFCC)，进入液泡。
滞绿基因蛋白SGR参与叶绿素代谢，不具有酶促活性，但却能够直接或间接与其它五种功能酶基因特异地在LHCII上互作。由此可见，STAYGREEN(SGR)在叶绿素代谢过程中占据着核心调控地位（“master” regulator）[1,2]。目前，关于SGR已知基因与叶绿素代谢相关蛋白互作的研究多见于拟南芥和水稻等模式植物和重要粮食作物中。拟南芥中包括三个SGR同源基因，分别为SGR1[也称为NYE1或NOC1]，SGR2和 SGRLIKE (SGRL)，它们在叶绿素降解中起着不同的作用[3]。在这三个SGR同源基因中，SGR1研究最多，结果表明自然衰老和暗诱导衰老条件下，拟南芥nye11 / sgr11突变体表现出持绿性状,而SGR1OX植物则表现出叶片提前衰老[4,5]。同时，非生物和生物胁迫下，nye11 / sgr11和noc11 / sgr12突变体在营养生长阶段[6,7]和种子成熟阶段[8]叶片持绿期较WT长,这表明在植物的生长发育中，SGR1在激活叶绿素降解方面起重要作用。 目前研究可知，与SGR已知基因互作的叶绿素代谢相关蛋白有NYC1、NOL、PPH等。
截止目前，叶绿素降解通路蛋白（CCEs）已鉴定出六个：Nonyellowing coloring1?(NYC1) [9,10] 、NYC1Like(NOL) [11] 、?7Hydroxymethyl chlorophyll a reductase(HCAR)[12]、Pheophytin pheophorbide hydrolase?(PPH) [13,14]、Pheophorbide a oxygenase?(PAO) [15,16] 、Red chlorophyll catabolite reductase?(RCCR) [17] 。并且，关于黑暗诱导衰老条件下SGR1和CCEs功能研究已在模式植物中取得较大进展[5,10,12,14,15,18]，Park等研究指出SGR1能够与光捕获系统II（LHCII）在体内结合[18] 。Sakuraba等研究指出拟南芥SGR1能够直接与其它六个CCEs 互作，并且它们只能特异地结合到LHCII上，从而形成LHCIISGR1CCEs动态复合体参与叶绿素的降解，并在未衰老组织中具有解毒功能。关于叶绿素中间产物代谢基因功能已在拟南芥[15,17,19,20] ，水稻[21]和玉米[22,23]中有所研究。至此，Sakuraba等总结前人研究成果并给出了一张SGR1与CCEs间作用机制图。
但是截至目前，关于单子叶植物尤其多年生牧草或草坪草（如黑麦草）中SGR1与CCEs间作用机制研究较少，现有报道仅通过体内和体外试验证实水稻NOL和NYC1间存在直接互作[11,13]，那么，其它CCEs间存在什么样的规律目前尚不清楚。
多年生黑麦草（Lolium perenne L.），属于禾本科早熟禾亚科黑麦草属（Lolium L.）植物，是温带地区重要的牧草和草坪草[24,25] ，多为二倍体[26]，目前基因组草图已经完成[27]，而且其遗传转化体系成熟[28]，故而黑麦草可作为研究多年生冷季型牧草和草坪草叶片衰老机制的模型。
酵母双杂交系统是筛选互作蛋白的重要方法，国内外都有很广泛的应用，在动植物病理学、免疫学、育种学等研究方面有着很重要的作用。Sakuraba[5]等利用酵母双杂交系统成功鉴定SGR和CCEs间互作。植物原生质体是指植物细胞去除细胞壁后剩余的完整结构体，首次经Cocking报道，它能够提供一个方便的细胞水平试验模型。通过适宜的转化方法，生物大分子比如DNA，RNA以及蛋白质均能转化进入原生质体中，从而探究其功能[29,30]。自从Sheen实验室报道拟南芥瞬时转化（TEAMP）法[31]以来，原生质体瞬时转化已迅速普及到拟南芥[29,31]，玉米[29]，烟草[32], 水稻[33,34], 洋葱表皮细胞[35,36]，杨树[37,38]，等等[39,40]。 目前这种方法已广泛应用于基因表达，蛋白亚细胞定位，蛋白与蛋白互作以及蛋白活性检测等研究中[29,38]。
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