象草青贮过程中微生物多样性的研究
摘要：象草(Pennisetum purpureum Schum)属于暖季型牧草，具有产量高、鲜嫩多汁、适口性好等特点。在中国南方，它们是重要的牧草，常以鲜草、干草或青贮饲料的形式用于反刍动物生产。本试验以象草为青贮原料，利用变性梯度凝胶电泳技术，旨在探讨象草自然青贮中微生物和乳酸菌演替的动态变化，为优质青贮饲料的生产提供理论依据和技术指导。结果表明：象草鲜样中，发现有不动杆菌、阿氏肠杆菌和泛菌属；青贮前3天发现短乳杆菌和乳酸乳球菌迅速增加，成为象草青贮前期的优势菌；青贮第5天后植物乳杆菌则占据了主导地位，有利于在青贮中建立稳定的乳酸菌体系，使青贮饲料更加稳定。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 青贮材料采集与处理 2
1.2 DNA 的提取 2
1.2.1 仪器： 2
1.2.2 试剂制备 2
1.2.3 DNA提取 3
1.3 DNA 含量、纯度及电泳检测 3
1.4 PCR 扩增 3
1.5 DGGE 分析微生物多样性 3
1.5.1 仪器 3
1.5.2试剂制备 3
1.5.3DGGE步骤 3
1.6 DGGE 条带的切割回收 3
1.7 TA克隆及测序 3
1.8 序列分析 3
2 结果与分析 4
2.1试验结果 4
2.2结果分析 5
3 讨论 6
致谢 6
参考文献 7
图1 4
表1 5
象草青贮过程中微生物多样性的研究
草业科学 田佳鹭
引言
引言：象草（Pennisetum purpureum Schum），是一种典型的暖季型牧草，属C4植物，原产于非洲，现已于热带和亚热带地区广泛种植。自十九世纪三十年代引入我国以来，在南方地区广泛种植，其具有生长快，产量高，鲜嫩多汁，适口性好等优点，是畜禽喜食的青绿饲料。而且
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
在华南等的热带地区，象草可以常绿过冬，这一特性使得象草在其他饲料作物凋零的冬季也能提供青绿饲料，缓解了冬季青绿饲料供应不足的压力[1]，在畜牧业生产中发挥着重要作用，是反刍动物重要的饲草来源，常以鲜草、干草或青贮饲料的形式供给家畜。
青贮饲料的调制历史悠久，是一种重要的饲草保存方法。青贮是将青绿饲料切短，装填至青贮窖中，在厌氧条件下，植物本身附着的乳酸菌利用水溶性碳水化合物，将其转化为乳酸和其他短链挥发性脂肪酸，随着酸的积累，青贮饲料的pH 逐渐下降，当达到临界水平时（大约4.2），各种有害微生物的活性被抑制，使青绿饲料得到长期保存[2]。王国仓等研究发现青贮过程中，主要微生物有乳酸菌、梭菌、腐败菌、醋酸菌、酵母菌和霉菌等，乳酸菌是促使青饲料发酵的主要有益微生物[3]。Pang等从玉米秸秆上分离并鉴定乳酸菌，其中86%是植物乳杆菌（L. plantarum）、戊糖乳杆菌（L. pentosus）和乳酸短乳杆菌。玉米青贮中魏斯氏菌属占主导地位，而在水稻、高粱和苜蓿青贮中植物乳杆菌占主导地位[4]。Li等还从玉米青贮中发现了一些不常见的乳酸菌，如耐酸乳杆菌（L. acetotolerans）、面包乳杆菌（L. panis）和儒氏乳杆菌（L. reuteri）[5]。蔡义民研究不同时期的青贮饲料分离出不同的乳酸菌，部分乳酸菌可以改善发酵品质，而分离出的明串珠菌和魏斯氏菌对青贮饲料的发酵没有明显改善[6]。许多研究结果表明不同植物表面附着的微生物种类与数量不同，将会影响牧草的青贮发酵品质，因此探讨牧草及青贮过程中微生物和乳酸菌多样性十分必要。
近几年，对青贮饲料中微生物多样性的研究多采用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)。马俊孝利用PCRDGGE在青贮中发现了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳链球菌(Streptococcus lactis)[7]。韩吉雨运用PCRDGGE技术发现了不同地区青贮玉米中的微生物的DGGE图谱基本相似[8]。Parvin等利用DGGE技术研究了青贮饲料发酵前期与后期中细菌和真菌的多样性[9]。党树锋运用PCRDGGE技术发现了青贮饲料中有布氏乳杆菌，短乳杆菌，戊糖乳杆菌[10]。席琳乔等结合DGGE技术对南疆地区不同代青贮复合系菌群结构的变化进行了研究[11]。保安安等利用PCRDGGE技术发现垂穗披碱草青贮体系中乳杆菌属为优势属，而片球菌属出现的频率较低，可能与片球菌属乳酸菌在青贮前期发挥作用，随着pH值的降低，逐渐被乳杆菌属的乳酸菌替代有关[12]。王彦苏等利用DGGE技术在水稻秸秆青贮中发现青贮前主要细菌为肠杆菌属、芽抱杆菌属、链球菌属，而其表面附着的乳酸菌含量极低[13]。研究表明对于青贮饲料中乳酸菌多样性的研究，是完全可以使用变性梯度凝胶电泳技术的。
本试验利用PCRDGGE技术，研究象草自然青贮过程中微生物和乳酸菌演替的动态变化，为优质青贮饲料的生产提供理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 青贮材料采集与处理
微生物多样性分析所用青贮饲料为2015年9月15日调制，选取青贮发酵第1,2,3,5,7和14天的样品。取各发酵时间点各处理组的象草青贮饲料50 g，加入200 ml无菌生理盐水，摇床上摇动2 h，再用一层无菌纱布过滤，滤液离心10 min，沉淀用2 ml无菌生理盐水重新悬浮，分装，置于?20℃冷冻冰箱中保存。
1.2 DNA 的提取
1.2.1 仪器：
细胞破碎仪（Biospec公司）
离心机（Thermo公司）
1.2.2 试剂制备
分别要制备0.1 M 磷酸缓冲液、组织裂解液及TrisEDTA溶液[14]。
1.2.3 DNA提取
采用苯酚氯仿法提取微生物DNA[15]。
1.3 DNA 含量、纯度及电泳检测
样品DNA 浓度和纯度使用核酸蛋白质检测仪（Eppendorf 公司）测定，使用1.5 %的琼脂糖凝胶进行电泳（电泳仪，DYY6C 型，北京六一仪器厂）。
1.4 PCR 扩增
PCR选用细菌16S rRNA V3 区通用引物，序列具体为GC357f(5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG3’含GC夹子)和517r (5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’)。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，扩增目的片段长度为160 bp。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 青贮材料采集与处理 2
1.2 DNA 的提取 2
1.2.1 仪器： 2
1.2.2 试剂制备 2
1.2.3 DNA提取 3
1.3 DNA 含量、纯度及电泳检测 3
1.4 PCR 扩增 3
1.5 DGGE 分析微生物多样性 3
1.5.1 仪器 3
1.5.2试剂制备 3
1.5.3DGGE步骤 3
1.6 DGGE 条带的切割回收 3
1.7 TA克隆及测序 3
1.8 序列分析 3
2 结果与分析 4
2.1试验结果 4
2.2结果分析 5
3 讨论 6
致谢 6
参考文献 7
图1 4
表1 5
象草青贮过程中微生物多样性的研究
草业科学 田佳鹭
引言
引言：象草（Pennisetum purpureum Schum），是一种典型的暖季型牧草，属C4植物，原产于非洲，现已于热带和亚热带地区广泛种植。自十九世纪三十年代引入我国以来，在南方地区广泛种植，其具有生长快，产量高，鲜嫩多汁，适口性好等优点，是畜禽喜食的青绿饲料。而且
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
在华南等的热带地区，象草可以常绿过冬，这一特性使得象草在其他饲料作物凋零的冬季也能提供青绿饲料，缓解了冬季青绿饲料供应不足的压力[1]，在畜牧业生产中发挥着重要作用，是反刍动物重要的饲草来源，常以鲜草、干草或青贮饲料的形式供给家畜。
青贮饲料的调制历史悠久，是一种重要的饲草保存方法。青贮是将青绿饲料切短，装填至青贮窖中，在厌氧条件下，植物本身附着的乳酸菌利用水溶性碳水化合物，将其转化为乳酸和其他短链挥发性脂肪酸，随着酸的积累，青贮饲料的pH 逐渐下降，当达到临界水平时（大约4.2），各种有害微生物的活性被抑制，使青绿饲料得到长期保存[2]。王国仓等研究发现青贮过程中，主要微生物有乳酸菌、梭菌、腐败菌、醋酸菌、酵母菌和霉菌等，乳酸菌是促使青饲料发酵的主要有益微生物[3]。Pang等从玉米秸秆上分离并鉴定乳酸菌，其中86%是植物乳杆菌（L. plantarum）、戊糖乳杆菌（L. pentosus）和乳酸短乳杆菌。玉米青贮中魏斯氏菌属占主导地位，而在水稻、高粱和苜蓿青贮中植物乳杆菌占主导地位[4]。Li等还从玉米青贮中发现了一些不常见的乳酸菌，如耐酸乳杆菌（L. acetotolerans）、面包乳杆菌（L. panis）和儒氏乳杆菌（L. reuteri）[5]。蔡义民研究不同时期的青贮饲料分离出不同的乳酸菌，部分乳酸菌可以改善发酵品质，而分离出的明串珠菌和魏斯氏菌对青贮饲料的发酵没有明显改善[6]。许多研究结果表明不同植物表面附着的微生物种类与数量不同，将会影响牧草的青贮发酵品质，因此探讨牧草及青贮过程中微生物和乳酸菌多样性十分必要。
近几年，对青贮饲料中微生物多样性的研究多采用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)。马俊孝利用PCRDGGE在青贮中发现了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳链球菌(Streptococcus lactis)[7]。韩吉雨运用PCRDGGE技术发现了不同地区青贮玉米中的微生物的DGGE图谱基本相似[8]。Parvin等利用DGGE技术研究了青贮饲料发酵前期与后期中细菌和真菌的多样性[9]。党树锋运用PCRDGGE技术发现了青贮饲料中有布氏乳杆菌，短乳杆菌，戊糖乳杆菌[10]。席琳乔等结合DGGE技术对南疆地区不同代青贮复合系菌群结构的变化进行了研究[11]。保安安等利用PCRDGGE技术发现垂穗披碱草青贮体系中乳杆菌属为优势属，而片球菌属出现的频率较低，可能与片球菌属乳酸菌在青贮前期发挥作用，随着pH值的降低，逐渐被乳杆菌属的乳酸菌替代有关[12]。王彦苏等利用DGGE技术在水稻秸秆青贮中发现青贮前主要细菌为肠杆菌属、芽抱杆菌属、链球菌属，而其表面附着的乳酸菌含量极低[13]。研究表明对于青贮饲料中乳酸菌多样性的研究，是完全可以使用变性梯度凝胶电泳技术的。
本试验利用PCRDGGE技术，研究象草自然青贮过程中微生物和乳酸菌演替的动态变化，为优质青贮饲料的生产提供理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 青贮材料采集与处理
微生物多样性分析所用青贮饲料为2015年9月15日调制，选取青贮发酵第1,2,3,5,7和14天的样品。取各发酵时间点各处理组的象草青贮饲料50 g，加入200 ml无菌生理盐水，摇床上摇动2 h，再用一层无菌纱布过滤，滤液离心10 min，沉淀用2 ml无菌生理盐水重新悬浮，分装，置于?20℃冷冻冰箱中保存。
1.2 DNA 的提取
1.2.1 仪器：
细胞破碎仪（Biospec公司）
离心机（Thermo公司）
1.2.2 试剂制备
分别要制备0.1 M 磷酸缓冲液、组织裂解液及TrisEDTA溶液[14]。
1.2.3 DNA提取
采用苯酚氯仿法提取微生物DNA[15]。
1.3 DNA 含量、纯度及电泳检测
样品DNA 浓度和纯度使用核酸蛋白质检测仪（Eppendorf 公司）测定，使用1.5 %的琼脂糖凝胶进行电泳（电泳仪，DYY6C 型，北京六一仪器厂）。
1.4 PCR 扩增
PCR选用细菌16S rRNA V3 区通用引物，序列具体为GC357f(5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG3’含GC夹子)和517r (5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’)。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，扩增目的片段长度为160 bp。
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