黑麦草青贮过程中乳酸菌多样性演替规律研究
摘要：意大利黑麦草是典型的冷季型牧草，是我国南方农区种植最广、播种面积最大的牧草之一。本研究旨在探讨意大利黑麦草青贮过程发酵品质和微生物的动态变化规律，以期解析微生物群落变化对牧草青贮发酵品质的影响。本文以意大利黑麦草为研究对象，选取抽穗期刈割制作青贮饲料，分别在青贮后第1，3，5，7，14和30 d打开青贮窖取样，分析发酵品质和微生物多样性。结果表明在青贮前期青贮饲料中附着的乳酸菌主要为肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属细菌，导致了乳酸快速产生，从而使青贮饲料pH快速降至4.20以下，之后球菌逐渐被产酸能力强的乳酸杆菌代替，其中部分乳酸杆菌为异型乳酸菌，导致了青贮过程中乳酸/乙酸逐渐下降。在青贮后期黑麦草青贮饲料中检测到了部分梭菌的存在，间接揭示了青贮30天后氨态氮和丁酸含量有较高的原因。
目录
1 材料与方法 2
1.1试验设计和青贮饲料的调制 2
1.1.1样品采集 2
1.1 .2青贮饲料的调制 3
1.2 测定项目与方法 3
1.2.1粗蛋白质测定 3
1.2.2 水溶性碳水化合物测定 3
1.2.3中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维测定 3
1.2.4缓冲能的测定 3
1.2.5微生物计数 3
1.2.6 pH测定 3
1.2.7乳酸的测定 3
1.2.8氨态氮的测定 3
1.2.8挥发性脂肪酸的测定 3
1.3细菌多样性分析 4
1.3.1 样品制备 4
1.3.2 DNA的提取 4
1.3.3 DNA含量、纯度及电泳检测 4
1.3.4 PCR扩增 4
1.3.5 DGGE分析细菌多样性 4
1.3.6 TA克隆及测序 4
1.3.7 序列分析 4
1.4数据统计方法 4
2 结果与分析 5
3 讨论 6
4 小结 7
黑麦草青贮过程中乳酸菌多样性演替规律
引言
引言
意大利黑麦草（Loliummultiflorum Lam.）
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
又名多花黑麦草，是一种典型的冷季型牧草，广泛的分布于温带、亚热带和热带，在美国、欧洲、澳洲等地常被用于饲喂反刍动物。意大利黑麦草是我国南方农区种植最广、播种面积最大的牧草之一，该品种营养物质丰富，高水溶性碳水化合物，品质优良、口感、适口性好，适宜各种畜禽的食用。将其作为青贮饲料不仅可以平衡优质饲草的供应，而且可缓解青绿饲草不足给畜牧业生产带来的压力。
青贮是指青贮材料上附着的乳酸菌利用原料中的发酵底物（可溶性糖）转化为乳酸和有机酸，产生酸性环境，降低pH值进而抑制或杀死有害微生物，有效保存原料营养成分，使饲料能长期保存的调制加工方法，其中乳酸菌是青贮发酵的“引擎”[1]。
青贮是一个复杂的微生态体系，微生物和生物化学变化贯穿整个青贮发酵过程，青贮饲料中存在的微生物种类很多，主要有乳酸菌、腐败菌、霉菌和酵母菌等，它们在青贮过程中呈现不同的活动状态和作用，每一阶段都有特殊的微生物参与代谢活动。
理想状态下，乳酸菌应在青贮过程中占据优势地位，但前人对不同原料和同一原料不同地区青贮饲料的研究发现所，并非一种乳酸菌在青贮中发挥作用，而是不同类型的多种乳酸菌共同作用的结果。在青贮发酵过程中，微生物是不断变化且有规律的。在正常微生态系统内，少数优势微生物种群对整个种群起决定作用，一旦失去了优势种群，则造成微生态失调，使用微生态制剂可补充或恢复优势种群，使失调的微生态达到新的平衡。青贮中的微生物呈现菌群演替变化及有益有害微生物的混杂现象，这就要求研究人员对青贮重新展开研究，以期对青贮发酵体系有个全面的认识，从而为调制优质青贮提供依据。
研究表明冷季型和暖季型牧草青贮发酵品质和模式存在显著差异，与冷季型牧草相比，暖季型牧草难以青贮成功。国外对青贮发酵品质及机理的研究最初主要集中在冷季型牧草，上世纪70年代开始才对暖季型牧草发酵机理进行研究，其研究方法和对发酵品质的评定借鉴于冷季型牧草。通常认为冷季型牧草青贮主要以乳酸发酵为主，而暖季型牧草青贮主要以产生乙酸型发酵为主，但Yokota等[2]研究象草青贮发酵动态变化，表明暖季型牧草青贮也能产生乳酸型发酵。Niimi等[3]对大黍草进行青贮，产生乙酸型青贮饲料，根据计算其水溶性碳水化合物含量与产生的乙酸含量的关系，认为所产生的乙酸量远大于来自牧草本身所含有的水溶性碳水化合物发酵所能产生的量，进一步分析其发酵过程中细胞壁成分的变化，发现半纤维素含量大量下降，并有少量的木糖产生，推测在水溶性碳水化合物不足的条件下，乳酸菌可能利用了牧草中结构性碳水化合物（半纤维素）作为发酵基质，产生乙酸，这一现象是由于暖季型牧草中存在的酶的作用还是由于其附着的特殊乳酸菌的作用，其机理仍不十分清楚。Shao等[4]于抽穗期收割大黍草并青贮，尽管水溶性碳水化合物较低，但仍产生乳酸型发酵，也许是由于暖季型牧草在不同的生长时期所附着的乳酸菌种类或者是各种乳酸菌菌群结构不同所致。Tohno等[5]认为牧草表面附着的微生物对于牧草的青贮发酵是至关重要的，特别自身附着的乳酸菌在宿主青贮发酵环境条件下具有独特潜力。但两者附着的乳酸菌种群结构比较研究尚未见报道，两者是否存在差异，乳酸菌群落差异是否对青贮发酵产生影响，及怎样影响发酵进程，进而引起发酵品质的差异，需进一步进行研究与探讨。
因此，本文选取冷季型牧草意大利黑麦草为原料，研究了其自然青贮过程中发酵品质和微生物的动态变化，为进一步揭示冷季型牧草和暖季型牧草青贮发酵差异奠定基础。
1 材料与方法
1.1试验设计和青贮饲料的调制
1.1.1样品采集
意大利黑麦草种植于江苏省农业科学院试验地，选取于处于抽穗期的意大利黑麦草收割。收割后，将意大利黑麦草装于无菌袋中并迅速带回实验室，切短（1 cm 左右）并充分混合。
1.1 .2青贮饲料的调制
将切短并充分混合的意大利黑麦草320 g装入450 ml的实验室青贮窖（聚乙烯瓶）中，密封，至于室温下保存。于青贮后1，3，5，7，14和30 d打开青贮窖，每个时间点3个重复。
同时对意大利黑麦草随机抽取样品3份，每份300 g用于化学成分测定；另取样品6份，3份（每份10 g）用于微生物计数，3份（每份25 g）用于缓冲能测定。
1.2 测定项目与方法
将各样品放置于105℃的烘箱中烘2 h，然后将烘箱调至65℃恒温继续烘60 h直至恒重，取出后立即放于干燥器中冷却，称量。计算干物质（Dry matter, DM）含量。将烘干的样品用微型粉碎机粉碎，过1 mm筛，用于测定粗蛋白质、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。青贮饲料开窖后，各窖立即取样品10 g加入90 ml无菌生理盐水，密封，至于摇床上以120 rpm min1，摇动2 h，用于LAB计数。取样品35 g加入70 ml蒸馏水，4℃浸提24 h，两层纱布和一层滤纸过滤，浸提液用于pH、乳酸、氨态氮（AmmoniaN, NH3N）和挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids, VFAs）含量的测定。
1.2.1粗蛋白质测定
采用凯式定氮法测定样品粗蛋白质（Crude protein, CP）含量[6]。
目录
1 材料与方法 2
1.1试验设计和青贮饲料的调制 2
1.1.1样品采集 2
1.1 .2青贮饲料的调制 3
1.2 测定项目与方法 3
1.2.1粗蛋白质测定 3
1.2.2 水溶性碳水化合物测定 3
1.2.3中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维测定 3
1.2.4缓冲能的测定 3
1.2.5微生物计数 3
1.2.6 pH测定 3
1.2.7乳酸的测定 3
1.2.8氨态氮的测定 3
1.2.8挥发性脂肪酸的测定 3
1.3细菌多样性分析 4
1.3.1 样品制备 4
1.3.2 DNA的提取 4
1.3.3 DNA含量、纯度及电泳检测 4
1.3.4 PCR扩增 4
1.3.5 DGGE分析细菌多样性 4
1.3.6 TA克隆及测序 4
1.3.7 序列分析 4
1.4数据统计方法 4
2 结果与分析 5
3 讨论 6
4 小结 7
黑麦草青贮过程中乳酸菌多样性演替规律
引言
引言
意大利黑麦草（Loliummultiflorum Lam.）
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
又名多花黑麦草，是一种典型的冷季型牧草，广泛的分布于温带、亚热带和热带，在美国、欧洲、澳洲等地常被用于饲喂反刍动物。意大利黑麦草是我国南方农区种植最广、播种面积最大的牧草之一，该品种营养物质丰富，高水溶性碳水化合物，品质优良、口感、适口性好，适宜各种畜禽的食用。将其作为青贮饲料不仅可以平衡优质饲草的供应，而且可缓解青绿饲草不足给畜牧业生产带来的压力。
青贮是指青贮材料上附着的乳酸菌利用原料中的发酵底物（可溶性糖）转化为乳酸和有机酸，产生酸性环境，降低pH值进而抑制或杀死有害微生物，有效保存原料营养成分，使饲料能长期保存的调制加工方法，其中乳酸菌是青贮发酵的“引擎”[1]。
青贮是一个复杂的微生态体系，微生物和生物化学变化贯穿整个青贮发酵过程，青贮饲料中存在的微生物种类很多，主要有乳酸菌、腐败菌、霉菌和酵母菌等，它们在青贮过程中呈现不同的活动状态和作用，每一阶段都有特殊的微生物参与代谢活动。
理想状态下，乳酸菌应在青贮过程中占据优势地位，但前人对不同原料和同一原料不同地区青贮饲料的研究发现所，并非一种乳酸菌在青贮中发挥作用，而是不同类型的多种乳酸菌共同作用的结果。在青贮发酵过程中，微生物是不断变化且有规律的。在正常微生态系统内，少数优势微生物种群对整个种群起决定作用，一旦失去了优势种群，则造成微生态失调，使用微生态制剂可补充或恢复优势种群，使失调的微生态达到新的平衡。青贮中的微生物呈现菌群演替变化及有益有害微生物的混杂现象，这就要求研究人员对青贮重新展开研究，以期对青贮发酵体系有个全面的认识，从而为调制优质青贮提供依据。
研究表明冷季型和暖季型牧草青贮发酵品质和模式存在显著差异，与冷季型牧草相比，暖季型牧草难以青贮成功。国外对青贮发酵品质及机理的研究最初主要集中在冷季型牧草，上世纪70年代开始才对暖季型牧草发酵机理进行研究，其研究方法和对发酵品质的评定借鉴于冷季型牧草。通常认为冷季型牧草青贮主要以乳酸发酵为主，而暖季型牧草青贮主要以产生乙酸型发酵为主，但Yokota等[2]研究象草青贮发酵动态变化，表明暖季型牧草青贮也能产生乳酸型发酵。Niimi等[3]对大黍草进行青贮，产生乙酸型青贮饲料，根据计算其水溶性碳水化合物含量与产生的乙酸含量的关系，认为所产生的乙酸量远大于来自牧草本身所含有的水溶性碳水化合物发酵所能产生的量，进一步分析其发酵过程中细胞壁成分的变化，发现半纤维素含量大量下降，并有少量的木糖产生，推测在水溶性碳水化合物不足的条件下，乳酸菌可能利用了牧草中结构性碳水化合物（半纤维素）作为发酵基质，产生乙酸，这一现象是由于暖季型牧草中存在的酶的作用还是由于其附着的特殊乳酸菌的作用，其机理仍不十分清楚。Shao等[4]于抽穗期收割大黍草并青贮，尽管水溶性碳水化合物较低，但仍产生乳酸型发酵，也许是由于暖季型牧草在不同的生长时期所附着的乳酸菌种类或者是各种乳酸菌菌群结构不同所致。Tohno等[5]认为牧草表面附着的微生物对于牧草的青贮发酵是至关重要的，特别自身附着的乳酸菌在宿主青贮发酵环境条件下具有独特潜力。但两者附着的乳酸菌种群结构比较研究尚未见报道，两者是否存在差异，乳酸菌群落差异是否对青贮发酵产生影响，及怎样影响发酵进程，进而引起发酵品质的差异，需进一步进行研究与探讨。
因此，本文选取冷季型牧草意大利黑麦草为原料，研究了其自然青贮过程中发酵品质和微生物的动态变化，为进一步揭示冷季型牧草和暖季型牧草青贮发酵差异奠定基础。
1 材料与方法
1.1试验设计和青贮饲料的调制
1.1.1样品采集
意大利黑麦草种植于江苏省农业科学院试验地，选取于处于抽穗期的意大利黑麦草收割。收割后，将意大利黑麦草装于无菌袋中并迅速带回实验室，切短（1 cm 左右）并充分混合。
1.1 .2青贮饲料的调制
将切短并充分混合的意大利黑麦草320 g装入450 ml的实验室青贮窖（聚乙烯瓶）中，密封，至于室温下保存。于青贮后1，3，5，7，14和30 d打开青贮窖，每个时间点3个重复。
同时对意大利黑麦草随机抽取样品3份，每份300 g用于化学成分测定；另取样品6份，3份（每份10 g）用于微生物计数，3份（每份25 g）用于缓冲能测定。
1.2 测定项目与方法
将各样品放置于105℃的烘箱中烘2 h，然后将烘箱调至65℃恒温继续烘60 h直至恒重，取出后立即放于干燥器中冷却，称量。计算干物质（Dry matter, DM）含量。将烘干的样品用微型粉碎机粉碎，过1 mm筛，用于测定粗蛋白质、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。青贮饲料开窖后，各窖立即取样品10 g加入90 ml无菌生理盐水，密封，至于摇床上以120 rpm min1，摇动2 h，用于LAB计数。取样品35 g加入70 ml蒸馏水，4℃浸提24 h，两层纱布和一层滤纸过滤，浸提液用于pH、乳酸、氨态氮（AmmoniaN, NH3N）和挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids, VFAs）含量的测定。
1.2.1粗蛋白质测定
采用凯式定氮法测定样品粗蛋白质（Crude protein, CP）含量[6]。
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