红三叶和苜蓿青贮过程中蛋白质降解的比较研究
摘要：豆科牧草是高产奶牛所需的优质的蛋白饲料，但青贮过程中会产生比较严重的蛋白降解，本试验通过比较两种豆科牧草（即苜蓿和红三叶）在青贮过程中发酵品质和蛋白质降解的差异，进一步明确两种牧草在调制青贮饲料过程中在发酵品质和蛋白质降解方面的特性，发现自然发酵条件下，紫花苜蓿和红三叶均较难青贮，但红三叶青贮发酵品质略优于紫花苜蓿。青贮过程中红三叶各非蛋白组分含量均显著低于紫花苜蓿，蛋白的保存效果优于紫花苜蓿。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.2 试验设计 3
1.3试验方法3
1.3.1 青贮保存3
1.3.2 开罐处理3
1.3.3测定指标及分析3
1.4 数据处理3
2 结果与分析4
2.1青贮前紫花苜蓿和红三叶主要化学成分4
2.2青贮30天后紫花苜蓿和红三叶青贮发酵品质4
2.3青贮30天后紫花苜蓿和红三叶主要化学成分含量5
2.4紫花苜蓿和红三叶青贮过程中氮组分含量的变化6
3 讨论7
4 结论9
致谢9
参考文献9
红三叶和苜蓿青贮过程中蛋白质降解的比较研究
引言
青贮是一种常规的牧草保存方式，特别是在一些湿润多雨地区，青贮饲料的调制更为普遍。国内外青贮饲料的来源主要以禾本科为主，禾本科水溶性碳水化合物含量高，易于青贮，但蛋白质含量低，营养价值难以满足家畜的营养需求。
豆科含有较高含量的蛋白质，其营养价值普遍高于禾本科牧草，但豆科牧草在青贮过程中因其具有较高的缓冲能，碳水化合物不足等特点而较难青贮。在豆科牧草青贮过程中，pH值难以迅速降低，往往伴随着大量的可溶性真蛋白在植物和微生物蛋白酶的作用下被降解成非蛋白氮，即肽氮，氨基酸氮和氨态氮等，这些非蛋白氮在瘤胃中被反刍动物的利用效率低，大量的氮元素以尿素的形式流失到体外，不仅给养殖者带来了不可估量的经济损失，同时也带来了严重的环境污染[1]。这一现象在苜蓿（Med
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
icago sativa）青贮中尤为严重，有研究表明：苜蓿在青贮过程中多达44–87%的牧草蛋白发生降解。与之相反，同为豆科牧草的红三叶(Trifoliumpratense)在青贮过程中牧草蛋白能得以大量保存，仅有少部分牧草蛋白发生降解[2]，经研究发现，这可能归因于红三叶中含有较高含量的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase）和邻苯二酚（ophenols），多酚氧化酶可以氧化邻苯二酚形成醌类（oquinones）物质，醌作为一种多电子化合物可以与蛋白质，多肽以及氨基酸等缺电子物质发生亲核反应，此反应可以通过两种途径起到抑制蛋白质降解的作用[3]，一是与植物蛋白形成稳定的蛋白酚结合体；二是与植物蛋白水解酶和微生物蛋白酶结合，钝化两类酶对植物蛋白的降解作用[4]。
本试验通过比较两种豆科牧草（即苜蓿和红三叶）在青贮过程中发酵品质和蛋白质降解的差异，进一步明确两种牧草在调制青贮饲料过程中在发酵品质和蛋白质降解方面的特性。
1 材料与方法
1．1 试验材料
紫花苜蓿和红三叶均种植于大学，采用相同的施肥管理，于2015年11月份刈割，采收时机为初花期，留茬高度为5 cm。田间凋萎至250 g/kg DM（dry matter；干重）左右后转运至实验室。
1．2 试验设计
青贮窖采用实验室青贮窖，容积为1 L的有内外盖的特制聚乙烯塑料桶。试验采用完全随机区组设计，设2个处理组：(1) 苜蓿组 (A)；(2) 红三叶组 (R)。在青贮后第3、5、7、14和30天打开实验室青贮窖，分析青贮饲料各项指标，每个处理各个时间点3个重复。
1．3 试验方法
1.3.1青贮饲料的调制
将凋萎后的紫花苜蓿和红三叶分别用铡刀切成1~2 cm左右，充分混合均匀后，逐层装填至1 L实验室青贮窖中，人工压实后盖上内外盖，并用胶带密封，置于室温下保存。
1.3.2样品处理
按照试验设计在不同青贮时间点分别打开实验室青贮窖，取出全部青贮饲料充分混合均匀，采用四分法称取20 g放入100 mL 的广口三角瓶，加入60 mL去离子水，4℃浸提24 h，然后通过双层纱布和滤纸过滤，将滤液冷冻保存于20℃冰箱待测。滤液用来测定pH值、乳酸、挥发性脂肪酸。将剩余的青贮饲料分成两份，一部份收集起来烘干，称重，测定干物质、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维。另一部采用冻干处理，测定非蛋白氮，总游离氨基酸氮和氨态氮。
1.3.3测定指标及分析方法
干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(crude ash，Ash)采用AOAC方法测定[5]；中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)采用范式纤维测定，其中NDF需加入耐高温α淀粉酶和亚硫酸钠；pH用HANNA pH 211型pH计测定；缓冲能(buffer capacity，BC)用盐酸、氢氧化钠滴定法测定；水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)采用蒽酮—硫酸比色法测定；总游离氨基酸氮(total free amino acid)采用茚三酮法；氨态氮(ammonia nitrogen，AN)采用苯酚次氯酸钠比色法测定；乳酸(lactic acid，LA)、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)和乙醇(alcohol)采用安捷伦1260高效液相检测系统，配备示差检测器，Carbomix?HNP5 色谱柱，(测试条件：55℃，2.5 mmol/L H2SO4，0.5 mL/ min)。非蛋白氮（nonprotein nitrogen）采用三氯乙酸（TCA）法[6]，即取0.5克左右冻干草粉，在250 ml锥形瓶中与10 ml无菌水室温下混合浸提3 h，之后添加2 ml 10% (w/v)的TCA在4℃环境下静置沉淀蛋白，24 h后15000×g离心15 min，取上清液用于测定总游离氨基酸氮和氨态氮，沉淀在25% (w/v)的TCA中重新溶解过滤，用相同浓度的TCA反复冲洗滤渣，将冲洗后的滤渣连同滤纸消煮后测定氮含量。肽氮(peptideN)的测量为浸提液在25℃ N2环境下，加入6 M HCl酸解后，游离氨基酸的释放量[7]。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.2 试验设计 3
1.3试验方法3
1.3.1 青贮保存3
1.3.2 开罐处理3
1.3.3测定指标及分析3
1.4 数据处理3
2 结果与分析4
2.1青贮前紫花苜蓿和红三叶主要化学成分4
2.2青贮30天后紫花苜蓿和红三叶青贮发酵品质4
2.3青贮30天后紫花苜蓿和红三叶主要化学成分含量5
2.4紫花苜蓿和红三叶青贮过程中氮组分含量的变化6
3 讨论7
4 结论9
致谢9
参考文献9
红三叶和苜蓿青贮过程中蛋白质降解的比较研究
引言
青贮是一种常规的牧草保存方式，特别是在一些湿润多雨地区，青贮饲料的调制更为普遍。国内外青贮饲料的来源主要以禾本科为主，禾本科水溶性碳水化合物含量高，易于青贮，但蛋白质含量低，营养价值难以满足家畜的营养需求。
豆科含有较高含量的蛋白质，其营养价值普遍高于禾本科牧草，但豆科牧草在青贮过程中因其具有较高的缓冲能，碳水化合物不足等特点而较难青贮。在豆科牧草青贮过程中，pH值难以迅速降低，往往伴随着大量的可溶性真蛋白在植物和微生物蛋白酶的作用下被降解成非蛋白氮，即肽氮，氨基酸氮和氨态氮等，这些非蛋白氮在瘤胃中被反刍动物的利用效率低，大量的氮元素以尿素的形式流失到体外，不仅给养殖者带来了不可估量的经济损失，同时也带来了严重的环境污染[1]。这一现象在苜蓿（Med
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
icago sativa）青贮中尤为严重，有研究表明：苜蓿在青贮过程中多达44–87%的牧草蛋白发生降解。与之相反，同为豆科牧草的红三叶(Trifoliumpratense)在青贮过程中牧草蛋白能得以大量保存，仅有少部分牧草蛋白发生降解[2]，经研究发现，这可能归因于红三叶中含有较高含量的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase）和邻苯二酚（ophenols），多酚氧化酶可以氧化邻苯二酚形成醌类（oquinones）物质，醌作为一种多电子化合物可以与蛋白质，多肽以及氨基酸等缺电子物质发生亲核反应，此反应可以通过两种途径起到抑制蛋白质降解的作用[3]，一是与植物蛋白形成稳定的蛋白酚结合体；二是与植物蛋白水解酶和微生物蛋白酶结合，钝化两类酶对植物蛋白的降解作用[4]。
本试验通过比较两种豆科牧草（即苜蓿和红三叶）在青贮过程中发酵品质和蛋白质降解的差异，进一步明确两种牧草在调制青贮饲料过程中在发酵品质和蛋白质降解方面的特性。
1 材料与方法
1．1 试验材料
紫花苜蓿和红三叶均种植于大学，采用相同的施肥管理，于2015年11月份刈割，采收时机为初花期，留茬高度为5 cm。田间凋萎至250 g/kg DM（dry matter；干重）左右后转运至实验室。
1．2 试验设计
青贮窖采用实验室青贮窖，容积为1 L的有内外盖的特制聚乙烯塑料桶。试验采用完全随机区组设计，设2个处理组：(1) 苜蓿组 (A)；(2) 红三叶组 (R)。在青贮后第3、5、7、14和30天打开实验室青贮窖，分析青贮饲料各项指标，每个处理各个时间点3个重复。
1．3 试验方法
1.3.1青贮饲料的调制
将凋萎后的紫花苜蓿和红三叶分别用铡刀切成1~2 cm左右，充分混合均匀后，逐层装填至1 L实验室青贮窖中，人工压实后盖上内外盖，并用胶带密封，置于室温下保存。
1.3.2样品处理
按照试验设计在不同青贮时间点分别打开实验室青贮窖，取出全部青贮饲料充分混合均匀，采用四分法称取20 g放入100 mL 的广口三角瓶，加入60 mL去离子水，4℃浸提24 h，然后通过双层纱布和滤纸过滤，将滤液冷冻保存于20℃冰箱待测。滤液用来测定pH值、乳酸、挥发性脂肪酸。将剩余的青贮饲料分成两份，一部份收集起来烘干，称重，测定干物质、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维。另一部采用冻干处理，测定非蛋白氮，总游离氨基酸氮和氨态氮。
1.3.3测定指标及分析方法
干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(crude ash，Ash)采用AOAC方法测定[5]；中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)采用范式纤维测定，其中NDF需加入耐高温α淀粉酶和亚硫酸钠；pH用HANNA pH 211型pH计测定；缓冲能(buffer capacity，BC)用盐酸、氢氧化钠滴定法测定；水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)采用蒽酮—硫酸比色法测定；总游离氨基酸氮(total free amino acid)采用茚三酮法；氨态氮(ammonia nitrogen，AN)采用苯酚次氯酸钠比色法测定；乳酸(lactic acid，LA)、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)和乙醇(alcohol)采用安捷伦1260高效液相检测系统，配备示差检测器，Carbomix?HNP5 色谱柱，(测试条件：55℃，2.5 mmol/L H2SO4，0.5 mL/ min)。非蛋白氮（nonprotein nitrogen）采用三氯乙酸（TCA）法[6]，即取0.5克左右冻干草粉，在250 ml锥形瓶中与10 ml无菌水室温下混合浸提3 h，之后添加2 ml 10% (w/v)的TCA在4℃环境下静置沉淀蛋白，24 h后15000×g离心15 min，取上清液用于测定总游离氨基酸氮和氨态氮，沉淀在25% (w/v)的TCA中重新溶解过滤，用相同浓度的TCA反复冲洗滤渣，将冲洗后的滤渣连同滤纸消煮后测定氮含量。肽氮(peptideN)的测量为浸提液在25℃ N2环境下，加入6 M HCl酸解后，游离氨基酸的释放量[7]。
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