两种牧草混合青贮发酵特性的研究及微生物多样性初探
摘要： 为了研究不同混合比例对紫花苜蓿和多花黑麦草混合青贮发酵特性的影响和发酵过程中微生物菌群存在的差异，本实验将紫花苜蓿和多花黑麦草按质量比为0:10；2:8；4:6；6:4；8:2；10:0进行混合青贮后对其发酵特性进行测定，又通过分子生物学中的酚氯仿提取法、碘化钠提取法、试剂盒法分别对青贮饲料进行DNA的提取实验比较，测定了不同比例紫花苜蓿和黑麦草混合青贮后所含微生物的DNA浓度，并对产物进行扩增以及变性梯度凝胶电泳（DGGE）的分析。结果表明：随着紫花苜蓿比例的增加，pH呈先上升后下降的趋势，其中处理5（A8B2）的pH最低；各处理间干物质（DM）含量差异不显著，处理5（A8B2）的含量最高；水溶性碳水化合物（WSC）和乳酸含量各处理差异不显著；且各处理中均无丙酸和丁酸，乙酸含量的差异不显著。当紫花苜蓿和多花黑麦草的混合青贮当质量比为8:2时，青贮效果最佳。微生物DNA提取方法中，试剂盒法的提取效果最好，DNA浓度适宜；其次是碘化钠法，酚氯仿法的效果最差；DGGE图谱表明且混合青贮样本的微生物种群具有差异性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料2
1.1.2 实验设计2
1.1.3 试剂和仪器2
1.2 实验方法3
1.2.1 青贮饲料发酵特性的测定3
1.2.2 青贮饲料DNA的提取3
1.2.3 DNA浓度、含量及电泳检测4
1.2.4 PCR扩增青贮微生物DNA片段4
1.2.5 DGGE分析青贮发酵体系菌群的差异性4
1．3 数据分析4
2 结果与分析4
2．1 不同比例混合青贮发酵特性的分析4
2.1.1不同比例混合青贮对pH值的影响4
2.1.2 不同比例混合青贮对干物质（DM）值的影响5
2.1.3 不同比例混合青贮对水溶性碳水化合物（WSC）的影响5
2.1.4 不同比例混合青贮对对乳酸（LA）的影响6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.1.5 不同混合比例对乙酸（AA）、丙酸（PrA）和丁酸（BA）的影响6
2．2 青贮饲料微生物的DNA提取7
2.2.1 DNA浓度和纯度的比较7
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果比较8
2.2.3 16S通用引物扩增的非变性凝胶电泳图谱9
2.2.4.扩增产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）图谱10
3 讨论 10
3．1 青贮饲料的发酵特性10
3．2 青贮饲料微生物DNA的提取10
致谢11
参考文献11
两种牧草混合青贮发酵特性的研究及微生物多样性初探
引言
紫花苜蓿是优质的豆科牧草，适口性好，营养价值高，但水溶性碳水化合物含量不足、蛋白质含量高而导致对酸的缓冲强，较难以直接青贮。多花黑麦草是优质的禾本科牧草，水溶性碳水化合物含量高，青贮容易成功，但粗蛋白含量低。因此，将两者混合青贮，能促进青贮过程中乳酸菌的发酵，抑制有害菌的生长，调节青贮的发酵基质，从而改善青贮饲料的品质，提高饲料的营养价值和家畜的利用率。本研究采用紫花苜蓿与多花黑麦草不同质量比0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0共6个处理混合青贮，发酵30d后取样对各处理发酵特性进行分析，探索不同混合比例对青贮发酵的影响。
微生物在青贮过程中起着重要的作用，然而传统研究青贮饲料微生物的方法是利用平板法将微生物进行分离，由于培养基都是具有一定的选择性的，所以有些微生物无论是从数量或者种类上来讲都是不能培养出来的。随着分子生物学的发展，提出了可以直接提取微生物DNA的方法来对其群落结构和数量进行分析，为解决这一问题提供了新的技术途径。本研究将通过3种不同的提取方法对青贮饲料的微生物DNA进行提取，然后用非变形和变性梯度凝胶电泳（DGGE）法对PCR扩增的产物进行分析，为日后研究微生物的菌群结构和种类的丰富度做出依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
紫花苜蓿“维多利亚”和多花黑麦草“牧遥”，播种于大学牌楼教学科研实践基地，常规田间水肥管理，刈割凋萎后青贮。青贮原料的化学成分见下表。
表1 青贮原料化学成分表
项目
材料
紫花苜蓿
多花黑麦草
水分含量(g/kg FW)
545.7
515.0
中性洗涤纤维(g/kg DM)
530.4
574.5
酸性洗涤纤维 (g/kg DM)
336.1
345.6
水溶性碳水化合物(g/kg DM)
106.9
177.6
粗脂肪(g/kg DM)
50.2
42.5
粗灰分(g/kg DM)
84.7
83.7
粗蛋白 (g/kg DM)
181.6
62.5
非蛋白氮 (g/kg CP)
292.3
168.4
1．1．2 实验设计
采用塑料袋（25(15 cm）青贮方法制作青贮饲料，分别按紫花苜蓿与黑麦草质量之比0:10（A0B10 ）；2:8（ A2B8）；4:6（A4B6）；6:4（A6B4）；8:2（A8B2）：10:0（A10B0）的比例进行混合，一共6个处理每个处理重复3次。试验材料用铡刀铡成小段后充分混匀，称取150 g装入真空袋中，利用真空封口机封口，于恒温环境中进行发酵。青贮30天后，取10 g样品放入200 mL锥形瓶，加90 mL去离子水，保鲜膜封口，4℃冰箱中浸提24 h，经四层纱布和定性滤纸过滤得浸提液，置于20℃冰箱中保存待测。
1．1．3 试剂和仪器
溶液的配置
PBS缓冲液： 称取8g Nacl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4 ，加500ml水，充分搅拌至溶解，用pH计调节至pH7.4，定容至1L。121℃灭菌20分钟，4℃保存。
细胞裂解液（Lysis Solution）：1%TritionX100；0.32M蔗糖；5mM MgCl?；10mM TrisHCl（pH7.5）；
酶反应液（Enzyme Reaction Solution）：1% SDS；5mM EDTANa?；10mM TrisHCl（pH8.0）；
蛋白酶解液（Proteinase Solution）：17mg/ml Proteinase K；
NaI溶解液：7.6M NaI；20mM EDTANa?；40mM TrisHCl（pH8.0）；
TE溶解液：10mM TrisHCl（pH8.0）；1mM EDTA
5×TBE缓冲液：在800ml水中加入54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/L EDTA（pH8.0)，加热溶解，定容至1L，0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。
其他主要试剂：三氯乙酸、丙烯酰胺、灭菌水、溶菌酶、DNA Marker、6×loading buffer、琼脂糖、DNA产物纯化试剂盒、PCR扩增引物等。
仪器
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料2
1.1.2 实验设计2
1.1.3 试剂和仪器2
1.2 实验方法3
1.2.1 青贮饲料发酵特性的测定3
1.2.2 青贮饲料DNA的提取3
1.2.3 DNA浓度、含量及电泳检测4
1.2.4 PCR扩增青贮微生物DNA片段4
1.2.5 DGGE分析青贮发酵体系菌群的差异性4
1．3 数据分析4
2 结果与分析4
2．1 不同比例混合青贮发酵特性的分析4
2.1.1不同比例混合青贮对pH值的影响4
2.1.2 不同比例混合青贮对干物质（DM）值的影响5
2.1.3 不同比例混合青贮对水溶性碳水化合物（WSC）的影响5
2.1.4 不同比例混合青贮对对乳酸（LA）的影响6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.1.5 不同混合比例对乙酸（AA）、丙酸（PrA）和丁酸（BA）的影响6
2．2 青贮饲料微生物的DNA提取7
2.2.1 DNA浓度和纯度的比较7
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果比较8
2.2.3 16S通用引物扩增的非变性凝胶电泳图谱9
2.2.4.扩增产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）图谱10
3 讨论 10
3．1 青贮饲料的发酵特性10
3．2 青贮饲料微生物DNA的提取10
致谢11
参考文献11
两种牧草混合青贮发酵特性的研究及微生物多样性初探
引言
紫花苜蓿是优质的豆科牧草，适口性好，营养价值高，但水溶性碳水化合物含量不足、蛋白质含量高而导致对酸的缓冲强，较难以直接青贮。多花黑麦草是优质的禾本科牧草，水溶性碳水化合物含量高，青贮容易成功，但粗蛋白含量低。因此，将两者混合青贮，能促进青贮过程中乳酸菌的发酵，抑制有害菌的生长，调节青贮的发酵基质，从而改善青贮饲料的品质，提高饲料的营养价值和家畜的利用率。本研究采用紫花苜蓿与多花黑麦草不同质量比0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0共6个处理混合青贮，发酵30d后取样对各处理发酵特性进行分析，探索不同混合比例对青贮发酵的影响。
微生物在青贮过程中起着重要的作用，然而传统研究青贮饲料微生物的方法是利用平板法将微生物进行分离，由于培养基都是具有一定的选择性的，所以有些微生物无论是从数量或者种类上来讲都是不能培养出来的。随着分子生物学的发展，提出了可以直接提取微生物DNA的方法来对其群落结构和数量进行分析，为解决这一问题提供了新的技术途径。本研究将通过3种不同的提取方法对青贮饲料的微生物DNA进行提取，然后用非变形和变性梯度凝胶电泳（DGGE）法对PCR扩增的产物进行分析，为日后研究微生物的菌群结构和种类的丰富度做出依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
紫花苜蓿“维多利亚”和多花黑麦草“牧遥”，播种于大学牌楼教学科研实践基地，常规田间水肥管理，刈割凋萎后青贮。青贮原料的化学成分见下表。
表1 青贮原料化学成分表
项目
材料
紫花苜蓿
多花黑麦草
水分含量(g/kg FW)
545.7
515.0
中性洗涤纤维(g/kg DM)
530.4
574.5
酸性洗涤纤维 (g/kg DM)
336.1
345.6
水溶性碳水化合物(g/kg DM)
106.9
177.6
粗脂肪(g/kg DM)
50.2
42.5
粗灰分(g/kg DM)
84.7
83.7
粗蛋白 (g/kg DM)
181.6
62.5
非蛋白氮 (g/kg CP)
292.3
168.4
1．1．2 实验设计
采用塑料袋（25(15 cm）青贮方法制作青贮饲料，分别按紫花苜蓿与黑麦草质量之比0:10（A0B10 ）；2:8（ A2B8）；4:6（A4B6）；6:4（A6B4）；8:2（A8B2）：10:0（A10B0）的比例进行混合，一共6个处理每个处理重复3次。试验材料用铡刀铡成小段后充分混匀，称取150 g装入真空袋中，利用真空封口机封口，于恒温环境中进行发酵。青贮30天后，取10 g样品放入200 mL锥形瓶，加90 mL去离子水，保鲜膜封口，4℃冰箱中浸提24 h，经四层纱布和定性滤纸过滤得浸提液，置于20℃冰箱中保存待测。
1．1．3 试剂和仪器
溶液的配置
PBS缓冲液： 称取8g Nacl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4 ，加500ml水，充分搅拌至溶解，用pH计调节至pH7.4，定容至1L。121℃灭菌20分钟，4℃保存。
细胞裂解液（Lysis Solution）：1%TritionX100；0.32M蔗糖；5mM MgCl?；10mM TrisHCl（pH7.5）；
酶反应液（Enzyme Reaction Solution）：1% SDS；5mM EDTANa?；10mM TrisHCl（pH8.0）；
蛋白酶解液（Proteinase Solution）：17mg/ml Proteinase K；
NaI溶解液：7.6M NaI；20mM EDTANa?；40mM TrisHCl（pH8.0）；
TE溶解液：10mM TrisHCl（pH8.0）；1mM EDTA
5×TBE缓冲液：在800ml水中加入54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/L EDTA（pH8.0)，加热溶解，定容至1L，0.1Mpa，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。
其他主要试剂：三氯乙酸、丙烯酰胺、灭菌水、溶菌酶、DNA Marker、6×loading buffer、琼脂糖、DNA产物纯化试剂盒、PCR扩增引物等。
仪器
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