改良海滨雀稗抗寒性的基因工程研究
海滨雀稗是重要的暖季型草坪草，具有极强的耐盐性，但抗寒性弱,限制了它的应用范围。本实验室前期研究证明，MfEF2的表达受低温诱导，过量表达MfEF2能提高转基因烟草的抗寒性。在此基础上，本实验构建了MfEF2的表达载体（pZG103-Ubi-MfEF2-bar），采用农杆菌介导的遗传转化法，将MfEF2基因导入海滨雀稗的愈伤组织，经过Basta抗性筛选，获得了转基因再生植株。对转基因再生植株进行PCR检测，扩增出EF2基因片段，初步鉴定转基因植物为阳性，为获得抗寒性提高的海滨雀稗转基因植株打下基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株、引物 2
1.3 外植体的消毒、接种 2
1.4 离体再生培养基 2
1.4.1 愈伤组织诱导及继代培养基 2
1.4.2 选择诱导培养基 2
1.4.3 选择再生培养基 2
1.5 诱导并继代胚性愈伤 3
1.6 抗性愈伤组织筛选与再生 3
1.7 农杆菌侵染及侵染前准备 3
1.7.1 农杆菌侵染前准备 3
1.7.2 农杆菌侵染过程 3
1.8 构建载体 3
1.8.1 设计引物并扩增目的基因 3
1.8.2 PCR产物回收纯化 3
1.8.3 连接克隆载体 4
1.8.4 热激转化大肠杆菌感受态及阳性克隆筛选 4
1.8.5 质粒提取 4
1.8.6 双酶切 5
1.8.7 酶切产物鉴定 5
1.8.8 终载体连接 5
1.8.9 热激转化 5
1.8.10 菌液检测 5
1.8.11 电击转化农杆菌及阳性克隆筛选 5
1.9 抗性植株PCR检测 5
1.9.1 CTAB法少量粗提DNA 5
1.9.2 初步检测bar基因插入转基因植株 6
1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
.9.3 初步检测MfEF2基因插入转基因植株 6
2 结果分析 6
2.1 构建MfEF2基因的过量表达载体 6
2.2 获得转基因抗性再生植株 7
2.3 PCR鉴定 9
3 实验结论 9
3．1 为获得抗除草剂转基因海滨雀稗新种质奠定基础 9
3．2 为获得抗寒性提高的转基因海滨雀稗新种质奠定基础 9
4 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
改良海滨雀稗抗寒性的基因工程研究
引言
低温是主要的环境胁迫之一，影响植物的生长和发育[]。海滨雀稗是重要的暖季型草坪草，具有极强的耐盐性，对土壤适应性强，极耐低修剪，但其抗寒性较差。海滨雀稗可用于建植高尔夫球场，公园绿地，足球场和家用草坪等，是目前最有发展潜力的暖季型草坪草之一。[]黎可华等对九种草坪草的抗寒性进行了评价，通过分析相对电导率、可溶性糖含量、光合速率以及寒害率指标的变化综合评价不同草坪草的抗寒性，发现海滨雀稗的耐寒性低于狗牙根和台湾草[]。刘湘林等研究表明海滨雀稗在10摄氏度适当低温条件下抗寒能力强，各抗寒生理指标变化小，这与黎可华的实验结果一致，但是在极度低温5摄氏度左右时抗寒物质增量减少，导致其骤然死亡。推测海滨雀稗的抗寒性受少数几个主基因控制[]。
黄花苜蓿（Medicago falcata L.）属于豆科苜蓿属多年生草本植物，生长多于寒冷地区。研究表明，在季节变化的任何阶段，野生黄花苜蓿的抗寒性都显著强于紫花苜蓿[、]。Weiser 首次提出植物抗寒性诱导过程中基因表达改变的观点，指出对于多年生木本植物，低温适应性可能需要特异基因转录激活以及在最大抗寒过程中新蛋白质诱导合成两个条件[]。延伸因子2（transcription factor 2 EF2）为真核生物蛋白质合成过程中所需辅助蛋白之一。EF2可以催化肽基tRNA?mRNA复合物从核糖体A位点转移至P位点，空出的A位点将接纳下一个新的氨酰tRNA。重复此过程，蛋白多肽链将最终被合成[、]。GuoY等在对冷诱导基因表达受抑制的拟南芥突变体研究中，发现EF2的突变会阻碍低温信号的传导，导致植株的抗寒能力降低[]。何思健等通过采用抑制削减杂交的方法，从黄花苜蓿和紫花苜蓿中分离出两者在冷胁迫下差异表达的基因MfEF2[]。
目前为止，有关EF2基因提高海滨雀稗抗寒性的研究未见报道。本实验将MfEF2基因作为目的基因，构建过量表达载体，并通过农杆菌介导的方法导入到海滨雀稗胚性愈伤组织，以期获得转基因阳性植株。从而为海滨雀稗抗寒性的研究提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
海滨雀稗（Paspalum vaginatum O. Swartz，2n=2x=20）品种‘Sea Spray’的成熟种子作为外植体材料，购于北京克劳沃草业技术开发中心。
受体材料：选择颜色鲜黄，结构密实，生长旺盛，具有高再生率的胚性愈伤组织为农杆菌介导转化的受体材料。
获得转基因抗性株系：在最优的转化条件下，获得农杆菌介导转化的抗性再生植株。
1.2 菌株、引物
引物：由软件Premier 5 设计，通过生工公司合成。
PCR 扩增bar 基因的引物为：
barF （5’GCTGCCAGAAACCCACG3’）；
barR （5’CTGCACCATCGTCAACCAC3’）。
扩增目的基因引物：由软件Oligo 7设计，通过金斯瑞公司合成。
F：(5’ACCACGGAAAATCGACTCTAACC3’)
R：(5’CGCCTCCTCTCCATCAACC3’)
酶切位点:
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株、引物 2
1.3 外植体的消毒、接种 2
1.4 离体再生培养基 2
1.4.1 愈伤组织诱导及继代培养基 2
1.4.2 选择诱导培养基 2
1.4.3 选择再生培养基 2
1.5 诱导并继代胚性愈伤 3
1.6 抗性愈伤组织筛选与再生 3
1.7 农杆菌侵染及侵染前准备 3
1.7.1 农杆菌侵染前准备 3
1.7.2 农杆菌侵染过程 3
1.8 构建载体 3
1.8.1 设计引物并扩增目的基因 3
1.8.2 PCR产物回收纯化 3
1.8.3 连接克隆载体 4
1.8.4 热激转化大肠杆菌感受态及阳性克隆筛选 4
1.8.5 质粒提取 4
1.8.6 双酶切 5
1.8.7 酶切产物鉴定 5
1.8.8 终载体连接 5
1.8.9 热激转化 5
1.8.10 菌液检测 5
1.8.11 电击转化农杆菌及阳性克隆筛选 5
1.9 抗性植株PCR检测 5
1.9.1 CTAB法少量粗提DNA 5
1.9.2 初步检测bar基因插入转基因植株 6
1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
.9.3 初步检测MfEF2基因插入转基因植株 6
2 结果分析 6
2.1 构建MfEF2基因的过量表达载体 6
2.2 获得转基因抗性再生植株 7
2.3 PCR鉴定 9
3 实验结论 9
3．1 为获得抗除草剂转基因海滨雀稗新种质奠定基础 9
3．2 为获得抗寒性提高的转基因海滨雀稗新种质奠定基础 9
4 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
改良海滨雀稗抗寒性的基因工程研究
引言
低温是主要的环境胁迫之一，影响植物的生长和发育[]。海滨雀稗是重要的暖季型草坪草，具有极强的耐盐性，对土壤适应性强，极耐低修剪，但其抗寒性较差。海滨雀稗可用于建植高尔夫球场，公园绿地，足球场和家用草坪等，是目前最有发展潜力的暖季型草坪草之一。[]黎可华等对九种草坪草的抗寒性进行了评价，通过分析相对电导率、可溶性糖含量、光合速率以及寒害率指标的变化综合评价不同草坪草的抗寒性，发现海滨雀稗的耐寒性低于狗牙根和台湾草[]。刘湘林等研究表明海滨雀稗在10摄氏度适当低温条件下抗寒能力强，各抗寒生理指标变化小，这与黎可华的实验结果一致，但是在极度低温5摄氏度左右时抗寒物质增量减少，导致其骤然死亡。推测海滨雀稗的抗寒性受少数几个主基因控制[]。
黄花苜蓿（Medicago falcata L.）属于豆科苜蓿属多年生草本植物，生长多于寒冷地区。研究表明，在季节变化的任何阶段，野生黄花苜蓿的抗寒性都显著强于紫花苜蓿[、]。Weiser 首次提出植物抗寒性诱导过程中基因表达改变的观点，指出对于多年生木本植物，低温适应性可能需要特异基因转录激活以及在最大抗寒过程中新蛋白质诱导合成两个条件[]。延伸因子2（transcription factor 2 EF2）为真核生物蛋白质合成过程中所需辅助蛋白之一。EF2可以催化肽基tRNA?mRNA复合物从核糖体A位点转移至P位点，空出的A位点将接纳下一个新的氨酰tRNA。重复此过程，蛋白多肽链将最终被合成[、]。GuoY等在对冷诱导基因表达受抑制的拟南芥突变体研究中，发现EF2的突变会阻碍低温信号的传导，导致植株的抗寒能力降低[]。何思健等通过采用抑制削减杂交的方法，从黄花苜蓿和紫花苜蓿中分离出两者在冷胁迫下差异表达的基因MfEF2[]。
目前为止，有关EF2基因提高海滨雀稗抗寒性的研究未见报道。本实验将MfEF2基因作为目的基因，构建过量表达载体，并通过农杆菌介导的方法导入到海滨雀稗胚性愈伤组织，以期获得转基因阳性植株。从而为海滨雀稗抗寒性的研究提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
海滨雀稗（Paspalum vaginatum O. Swartz，2n=2x=20）品种‘Sea Spray’的成熟种子作为外植体材料，购于北京克劳沃草业技术开发中心。
受体材料：选择颜色鲜黄，结构密实，生长旺盛，具有高再生率的胚性愈伤组织为农杆菌介导转化的受体材料。
获得转基因抗性株系：在最优的转化条件下，获得农杆菌介导转化的抗性再生植株。
1.2 菌株、引物
引物：由软件Premier 5 设计，通过生工公司合成。
PCR 扩增bar 基因的引物为：
barF （5’GCTGCCAGAAACCCACG3’）；
barR （5’CTGCACCATCGTCAACCAC3’）。
扩增目的基因引物：由软件Oligo 7设计，通过金斯瑞公司合成。
F：(5’ACCACGGAAAATCGACTCTAACC3’)
R：(5’CGCCTCCTCTCCATCAACC3’)
酶切位点:
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