具有芘降解功能的植物内生细菌的分离筛选及其特性
本文采用富集培养法，从长期受PAHs污染的植物体内分离筛选出1株能以芘为唯一碳源和能源生长的芘降解内生细菌Spr，经形态观察、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析，将菌株初步鉴定为沙雷氏菌属。并研究了此株内生细菌对芘的降解能力及环境条件对其生长和芘降解的影响。该菌株能以芘为唯一碳源生长，于30 ℃、150 r?min-1摇床培养10 d后，对芘的降解率为51.3%。该菌株有较强的环境适应能力。结果表明，pH值 ( 6.0 ~ 8.0 )、盐浓度 ( NaCl含量为0 ~ 20 g·L-1 ) 及装液量20-50mL（100mL三角瓶），菌株生长良好。其最适生长和降解条件pH值 ( 6.0 ~ 8.0 )、接种量15%及60 mg·L-1底物浓度。菌株为好氧生长，通气量越大，菌株生长越旺盛，对芘的降解能力越强，对芘的降解效果越大。
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 生物材料 2
1．1．2 化学试剂 2
1．1．3 培养基 2
1．2 具有降解芘功能内生细菌的分离筛选 2
1．2．1 采样点 2
1．2．2 筛选方法 3
1．3 菌株鉴定 3
1．3．1 菌株生理生化性质分析 3
1．3．2 菌株16S rDNA序列同源性分析测定 3
1．3．3 菌株系统发育树 3
1．4 菌株生长和芘降解试验 3
1．4．1 生长试验 3
1．4．2 降解试验 3
1．5 环境条件对菌株生长的影响 4
1．5．1 盐浓度的影响 4
1．5．2 pH值的影响 4
1．5．3 通气量的影响 4
1．6 环境条件对芘的降解试验的影响 4
1．6．1 pH值的影响 4
1．6．2 接种量的影响 4
1．6．3 底物浓度的影响 4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2 结果与分析 4
2．1 菌株的鉴定 4
2．1．1 菌株Spr的形态特征和生理生化性质 4
2．1．2 菌株16S rDNA序列同源性分析 5
2．2 细菌的生长与降解曲线 6
2．2．1 菌株的生长曲线 6
2．2．2 降解曲线 6
2．3 环境条件对菌株生长的影响 6
2．3．1 盐浓度的影响 6
2．3．2 pH值的影响 6
2．3．3 通气量的影响 7
2．4 环境条件对菌株降解效能的影响 7
2．4．1 pH值对菌株降解效能的影响 7
2．4．2 接种量对菌株降解效能的影响 8
2．4．3 底物浓度对菌株降解效能的影响 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
References 9
图21 菌落照片 4
图22 透射电镜照片 4
表21 菌株的生理生化特性 5
图23 基于16S rDNA基因序列同源性的菌株系统发育树 5
图24 菌株生长曲线 6
图25 菌株培养液中芘残留随时间的变化 6
图26 盐浓度对菌株生长的影响 6
图27 pH对菌株生长的影响 7
图28 通气量对菌株生长的影响 7
图31 pH值对菌株的芘降解的影响 7
图32接种量对菌株的芘降解的影响 8
图33 底物浓度对菌株的芘降解的影响 8
具有芘降解功能的植物内生细菌的分离筛选及其特性
引言
引言 土壤是生态系统的重要组成部分，是人类生存与发展的基石。随着经济发展，土壤有机污染问题正不断扩大与加深。多环芳烃 ( PAHs ) 是土壤中广泛存在的持久性有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的毒性作用，能通过食物链富集进而威胁人群健康[14]。由于多环芳烃是一类疏水性有机化合物，在水中的溶解度很小，具有较高的辛醇水分配系数，易在土壤中积累，所以土壤成为其主要载体[5]。芘是由四个苯环对称排列组成的稠环芳烃，结构稳定，是PAHs中一种典型的难降解高分子量代表化合物，被作为监测PAHs污染的指示物和其它PAHs光化学降解、生物降解的模型分子之一[6,7]。
近年来，利用植物与微生物联合修复污染土壤进而保证农产品安全的治理途径受到研究者的广泛重视。植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物[8]。植物内生细菌具有丰富的生物多样性[9]。不仅可通过调节植物体内激素、酶的分泌影响植物体内物质代谢[10,11]，同时植物内生细菌可改善植物营养[12]、降低植物病菌感染[13]、提高植物抗逆性[14]等。筛选具有降解有PAHs功能的植物内生细菌，并将其定殖于植物体内，可以降解土壤环境中的PAHs从而降低污染，同时有望调控植物体内PAHs的代谢过程，从而有效地降低植物PAHs污染的风险。陈小兵等[15]研究指出，内生细菌Enterobacter sp. 7J2对一定浓度菲具有较好的降解效果，且该菌可在小麦体内定殖，并能促进小麦生长。研究表明，具有降解污染物特性的植物内生细菌可以改变土壤有机物在植物体内的归宿，从而影响污染物在植物体内的积累[16,17]。
本研究选择芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选能以芘为唯一碳源和能源的高效芘降解细菌，并研究生物学特性，探索其在不同环境条件下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 生物材料
供试植株 采自江苏省南京市江宁扬子石化芳烃厂排污口区。植株生长良好，采集后立即带回实验室进行芘降解菌的分离筛选。
1．1．2 化学试剂
芘 ( 纯度>98% ) 购于德国Fluka公司，分子量202.26 gmol1、纯水中溶解度为0.12 mgL1、辛醇水分配系数 (logKow ) 为5.18。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
PCR引物购自上海英骏生物技术有限公司。
1．1．3 培养基
LB培养基：蛋白胨 10 gL1，酵母粉 5 gL1，NaCl 10 gL1，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加1520g琼脂(1L)。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 生物材料 2
1．1．2 化学试剂 2
1．1．3 培养基 2
1．2 具有降解芘功能内生细菌的分离筛选 2
1．2．1 采样点 2
1．2．2 筛选方法 3
1．3 菌株鉴定 3
1．3．1 菌株生理生化性质分析 3
1．3．2 菌株16S rDNA序列同源性分析测定 3
1．3．3 菌株系统发育树 3
1．4 菌株生长和芘降解试验 3
1．4．1 生长试验 3
1．4．2 降解试验 3
1．5 环境条件对菌株生长的影响 4
1．5．1 盐浓度的影响 4
1．5．2 pH值的影响 4
1．5．3 通气量的影响 4
1．6 环境条件对芘的降解试验的影响 4
1．6．1 pH值的影响 4
1．6．2 接种量的影响 4
1．6．3 底物浓度的影响 4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2 结果与分析 4
2．1 菌株的鉴定 4
2．1．1 菌株Spr的形态特征和生理生化性质 4
2．1．2 菌株16S rDNA序列同源性分析 5
2．2 细菌的生长与降解曲线 6
2．2．1 菌株的生长曲线 6
2．2．2 降解曲线 6
2．3 环境条件对菌株生长的影响 6
2．3．1 盐浓度的影响 6
2．3．2 pH值的影响 6
2．3．3 通气量的影响 7
2．4 环境条件对菌株降解效能的影响 7
2．4．1 pH值对菌株降解效能的影响 7
2．4．2 接种量对菌株降解效能的影响 8
2．4．3 底物浓度对菌株降解效能的影响 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
References 9
图21 菌落照片 4
图22 透射电镜照片 4
表21 菌株的生理生化特性 5
图23 基于16S rDNA基因序列同源性的菌株系统发育树 5
图24 菌株生长曲线 6
图25 菌株培养液中芘残留随时间的变化 6
图26 盐浓度对菌株生长的影响 6
图27 pH对菌株生长的影响 7
图28 通气量对菌株生长的影响 7
图31 pH值对菌株的芘降解的影响 7
图32接种量对菌株的芘降解的影响 8
图33 底物浓度对菌株的芘降解的影响 8
具有芘降解功能的植物内生细菌的分离筛选及其特性
引言
引言 土壤是生态系统的重要组成部分，是人类生存与发展的基石。随着经济发展，土壤有机污染问题正不断扩大与加深。多环芳烃 ( PAHs ) 是土壤中广泛存在的持久性有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的毒性作用，能通过食物链富集进而威胁人群健康[14]。由于多环芳烃是一类疏水性有机化合物，在水中的溶解度很小，具有较高的辛醇水分配系数，易在土壤中积累，所以土壤成为其主要载体[5]。芘是由四个苯环对称排列组成的稠环芳烃，结构稳定，是PAHs中一种典型的难降解高分子量代表化合物，被作为监测PAHs污染的指示物和其它PAHs光化学降解、生物降解的模型分子之一[6,7]。
近年来，利用植物与微生物联合修复污染土壤进而保证农产品安全的治理途径受到研究者的广泛重视。植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物[8]。植物内生细菌具有丰富的生物多样性[9]。不仅可通过调节植物体内激素、酶的分泌影响植物体内物质代谢[10,11]，同时植物内生细菌可改善植物营养[12]、降低植物病菌感染[13]、提高植物抗逆性[14]等。筛选具有降解有PAHs功能的植物内生细菌，并将其定殖于植物体内，可以降解土壤环境中的PAHs从而降低污染，同时有望调控植物体内PAHs的代谢过程，从而有效地降低植物PAHs污染的风险。陈小兵等[15]研究指出，内生细菌Enterobacter sp. 7J2对一定浓度菲具有较好的降解效果，且该菌可在小麦体内定殖，并能促进小麦生长。研究表明，具有降解污染物特性的植物内生细菌可以改变土壤有机物在植物体内的归宿，从而影响污染物在植物体内的积累[16,17]。
本研究选择芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选能以芘为唯一碳源和能源的高效芘降解细菌，并研究生物学特性，探索其在不同环境条件下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 生物材料
供试植株 采自江苏省南京市江宁扬子石化芳烃厂排污口区。植株生长良好，采集后立即带回实验室进行芘降解菌的分离筛选。
1．1．2 化学试剂
芘 ( 纯度>98% ) 购于德国Fluka公司，分子量202.26 gmol1、纯水中溶解度为0.12 mgL1、辛醇水分配系数 (logKow ) 为5.18。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
PCR引物购自上海英骏生物技术有限公司。
1．1．3 培养基
LB培养基：蛋白胨 10 gL1，酵母粉 5 gL1，NaCl 10 gL1，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加1520g琼脂(1L)。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
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