青枯菌专性噬菌体的分离鉴定及应用研究(附件)
番茄青枯病作为一种全球性的病害，严重制约着番茄产业的发展。由于物理措施及化学防治的局限性，青枯病的生物防治逐渐成为研究热点。本研究从发病的番茄植株根际土壤中分离筛选出高效的专性噬菌体NN-P42，以此作为研究材料，研究其生物学特性及应用效果，试验结果表明噬菌体NN-P42具备抵御青枯菌入侵的能力，在一定程度上能够降低番茄青枯病的发病率。另外，本研究还发现调控植物根际资源能够使噬菌体对青枯菌产生不同的防控效果低营养条件下能够稳定抑制，而高营养条件下抑制效果会在一段时间过后逐渐减弱。据此猜测高营养条件下往往能够激发青枯菌病原菌产生对抗噬菌体的抗性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.1.1 供试菌株和番茄 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 青枯菌特异性噬菌体的筛选2
1.2.2 噬菌体鉴定与生物学特性研究3
1.2.3 噬菌体抑制青枯菌的室内微孔板实验4
1.2.4 噬菌体防控青枯病的应用效果研究4
2 结果与分析5
2.1 噬菌体的分离和鉴定5
2.1.1 噬菌体的筛选5
2.1.2 噬菌体的形态观察5
2.1.3 噬菌体蛋白的SDSPAGE分析6
2.1.4 噬菌体的基因组信息6
2.2 噬菌体的货架期评价7
2.2.1 保存温度7
2.2.2 保存溶剂7
2.3 噬菌体防控青枯病效果7
2.3.1 不同资源条件下噬菌体抑制青枯菌的效果 7
2.3.2 温室盆栽实验8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
青枯菌专性噬菌体的分离鉴定及应用研究
引言
引言 番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传性维管束病害[1]，主要分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
布在世界上许多热带、亚热带，即温度较高的地区[2]，其中也包括我国长江以南的许多地区[3]。番茄青枯病目前已造成全球大范围的灾难性病害爆发，对番茄产业的发展产生巨大影响[4]。造成这种现象的主要原因在于青枯病病原菌的变异性较强且寄主范围较广[5]，因而一旦发病便会失去控制，常常会造成番茄植株的大面积枯萎，大大降低番茄的产量[4]。青枯病菌能够随番茄植株的残株过冬，在土壤中甚至6年都不会死亡，该病原菌不仅会由灌溉水和雨水引起传播，人类、生畜、耕具、昆虫和线虫等都能引起病菌不断地反复侵染、蔓延[6]。因此，对于番茄青枯病的研究不断引起国内外的重视，越来越多的学者致力于寻找防治青枯病的有效方法。
目前，对于青枯病在实际中的防治主要包括几种情况：一方面可通过一些农业措施适当减少其发病率，主要包括土壤改良、合理施肥、嫁接与轮作等，但这些措施难以从根本上解决问题[7]；另一方面主要是采用化学防治和研发抗病品种的方法，而化学药剂的防治效果通常会对土壤、水环境造成污染[8]，抗病品种的选育工作又较难进行，高抗青枯病的品种非常少[9,10]。因此，相比之下青枯病的生物防治更为有效，不仅能从根本上抑制青枯病菌，并且不会对环境造成污染，若能在实际生产中取得大范围应用，那么青枯病的防治则指日可待。
目前关于青枯病的生物防治主要从芽孢杆菌、无致病力青枯菌菌株、噬菌体等几种微生物入手，本研究主要针对青枯菌专性噬菌体进行筛选鉴定，以便探究其生物防治效果。噬菌体的优点在于能够侵染细菌、放线菌、真菌等多种微生物，分布范围也十分广泛，因此可以在土壤中找到能够侵染细菌的噬菌体[11]，为噬菌体防控青枯病的研究提供先决条件。Twort[12]和d’Herelle[13]分别在1915年琼脂培养葡萄球菌以及1917年液体培养痢疾杆菌的过程中发现并分离出了噬菌体，由此引发人们对于噬菌体防治细菌性病害的探索。伴随着抗生素从出现到其耐药性的不断增强[14]，噬菌体经历了由曾经淡出人们视线到又重新引起重视[15]的过程，而现在已逐渐被更多的人们研究与利用。侵染细菌的噬菌体又称为细菌病毒，它能够自我复制、仅对寄主菌产生裂解作用，并且对环境没有毒害、便于分离、复制以及保存[16,17]，基于以上多种优点，噬菌体疗法在防治包括青枯病等多种农作物病害上都具备广泛的应用前景。
纵观近年来关于噬菌体防治青枯病的研究，噬菌体疗法的开发与应用已取得一些进展，如Tanaka等[18]从青枯菌中筛选出能有效降低烟草青枯病的噬菌体菌株；Kawasaki等[19]以及Yamada等[20]均分离出了能够侵染青枯菌的噬菌体；Fujiwara等[21]发现经噬菌体处理的番茄植株发病率降低，以上研究均证明了噬菌体防控青枯病具备可行性。本课题旨在通过分离筛选出高效裂解青枯菌的专性噬菌体，进一步探究噬菌体的生物学特性、抵御青枯菌入侵的能力，为提高噬菌体防控青枯病的效率提供研究基础。
1 材料与方法
1．1 供试材料
1．1．1 供试菌株和番茄
供试菌株：采用实验室中保存的具有强致病力的青枯菌QLRS1115，分离自南京市麒麟镇蔬菜大棚发病番茄植株根际，后面简称RS。
供试番茄：番茄采用MicroTom品种，它具有植株较为矮且小、生命周期不长、对光照要求不严等特点，适于本研究的展开。
1．1．2 主要试剂
液体NA培养基：按葡萄糖10 g/L，蛋白胨（Tryptone）5 g/L ，牛肉浸膏3 g/L， 酵母粉 (Yeast extract) 0.5 g/L,调节 pH为7.0, 在105℃下灭菌30 min；
半固体NA培养基：在液体NA培养基中加入需配置溶液体积1％的琼脂条；
固体NA培养基：在液体NA培养基加入需配置溶液体积2％的琼脂条。
1．1．3 主要仪器
酶标仪、电子显微镜。
1．2 试验方法
1．2．1 青枯菌特异性噬菌体的筛选
配制土壤悬浮液，即每90 mLSM悬浮液中加入10g土壤样品，混合后振荡一晚，然后静置一天以上。制成的土壤悬浮液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液5 mL与对数生长期的宿主菌菌液混合，在30℃，200 r/min下振荡12小时，然后用0.22 μm滤膜过滤其离心后的上清液，获得噬菌体原液。
用SM稀释噬菌体原液，按10倍倍比的浓度梯度分别稀释到101、102、103、104、105、106、107和108备用。取0.5 mL生长到对数期的病原菌菌液，混合到6 mL已冷却到55℃以下的半固体NA培养基，然后快速倒到NA固体培养基上，制备而成的双层平板经半固体层凝固后[22]，将其分区，分别点接之前稀释好的噬菌体原液各2 μL。在30℃下倒置培养12天，然后观察是否有噬菌斑出现。从出现的噬菌斑中挑取体积最大的一个，然后将其接入宿主菌菌液，摇匀并静置15 min后，在30℃，170 r/min下振荡12小时，经滤膜过滤后按上述步骤制成双层平板，继续重复这一操作35次以获得纯化的噬菌体。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.1.1 供试菌株和番茄 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 青枯菌特异性噬菌体的筛选2
1.2.2 噬菌体鉴定与生物学特性研究3
1.2.3 噬菌体抑制青枯菌的室内微孔板实验4
1.2.4 噬菌体防控青枯病的应用效果研究4
2 结果与分析5
2.1 噬菌体的分离和鉴定5
2.1.1 噬菌体的筛选5
2.1.2 噬菌体的形态观察5
2.1.3 噬菌体蛋白的SDSPAGE分析6
2.1.4 噬菌体的基因组信息6
2.2 噬菌体的货架期评价7
2.2.1 保存温度7
2.2.2 保存溶剂7
2.3 噬菌体防控青枯病效果7
2.3.1 不同资源条件下噬菌体抑制青枯菌的效果 7
2.3.2 温室盆栽实验8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
青枯菌专性噬菌体的分离鉴定及应用研究
引言
引言 番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传性维管束病害[1]，主要分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
布在世界上许多热带、亚热带，即温度较高的地区[2]，其中也包括我国长江以南的许多地区[3]。番茄青枯病目前已造成全球大范围的灾难性病害爆发，对番茄产业的发展产生巨大影响[4]。造成这种现象的主要原因在于青枯病病原菌的变异性较强且寄主范围较广[5]，因而一旦发病便会失去控制，常常会造成番茄植株的大面积枯萎，大大降低番茄的产量[4]。青枯病菌能够随番茄植株的残株过冬，在土壤中甚至6年都不会死亡，该病原菌不仅会由灌溉水和雨水引起传播，人类、生畜、耕具、昆虫和线虫等都能引起病菌不断地反复侵染、蔓延[6]。因此，对于番茄青枯病的研究不断引起国内外的重视，越来越多的学者致力于寻找防治青枯病的有效方法。
目前，对于青枯病在实际中的防治主要包括几种情况：一方面可通过一些农业措施适当减少其发病率，主要包括土壤改良、合理施肥、嫁接与轮作等，但这些措施难以从根本上解决问题[7]；另一方面主要是采用化学防治和研发抗病品种的方法，而化学药剂的防治效果通常会对土壤、水环境造成污染[8]，抗病品种的选育工作又较难进行，高抗青枯病的品种非常少[9,10]。因此，相比之下青枯病的生物防治更为有效，不仅能从根本上抑制青枯病菌，并且不会对环境造成污染，若能在实际生产中取得大范围应用，那么青枯病的防治则指日可待。
目前关于青枯病的生物防治主要从芽孢杆菌、无致病力青枯菌菌株、噬菌体等几种微生物入手，本研究主要针对青枯菌专性噬菌体进行筛选鉴定，以便探究其生物防治效果。噬菌体的优点在于能够侵染细菌、放线菌、真菌等多种微生物，分布范围也十分广泛，因此可以在土壤中找到能够侵染细菌的噬菌体[11]，为噬菌体防控青枯病的研究提供先决条件。Twort[12]和d’Herelle[13]分别在1915年琼脂培养葡萄球菌以及1917年液体培养痢疾杆菌的过程中发现并分离出了噬菌体，由此引发人们对于噬菌体防治细菌性病害的探索。伴随着抗生素从出现到其耐药性的不断增强[14]，噬菌体经历了由曾经淡出人们视线到又重新引起重视[15]的过程，而现在已逐渐被更多的人们研究与利用。侵染细菌的噬菌体又称为细菌病毒，它能够自我复制、仅对寄主菌产生裂解作用，并且对环境没有毒害、便于分离、复制以及保存[16,17]，基于以上多种优点，噬菌体疗法在防治包括青枯病等多种农作物病害上都具备广泛的应用前景。
纵观近年来关于噬菌体防治青枯病的研究，噬菌体疗法的开发与应用已取得一些进展，如Tanaka等[18]从青枯菌中筛选出能有效降低烟草青枯病的噬菌体菌株；Kawasaki等[19]以及Yamada等[20]均分离出了能够侵染青枯菌的噬菌体；Fujiwara等[21]发现经噬菌体处理的番茄植株发病率降低，以上研究均证明了噬菌体防控青枯病具备可行性。本课题旨在通过分离筛选出高效裂解青枯菌的专性噬菌体，进一步探究噬菌体的生物学特性、抵御青枯菌入侵的能力，为提高噬菌体防控青枯病的效率提供研究基础。
1 材料与方法
1．1 供试材料
1．1．1 供试菌株和番茄
供试菌株：采用实验室中保存的具有强致病力的青枯菌QLRS1115，分离自南京市麒麟镇蔬菜大棚发病番茄植株根际，后面简称RS。
供试番茄：番茄采用MicroTom品种，它具有植株较为矮且小、生命周期不长、对光照要求不严等特点，适于本研究的展开。
1．1．2 主要试剂
液体NA培养基：按葡萄糖10 g/L，蛋白胨（Tryptone）5 g/L ，牛肉浸膏3 g/L， 酵母粉 (Yeast extract) 0.5 g/L,调节 pH为7.0, 在105℃下灭菌30 min；
半固体NA培养基：在液体NA培养基中加入需配置溶液体积1％的琼脂条；
固体NA培养基：在液体NA培养基加入需配置溶液体积2％的琼脂条。
1．1．3 主要仪器
酶标仪、电子显微镜。
1．2 试验方法
1．2．1 青枯菌特异性噬菌体的筛选
配制土壤悬浮液，即每90 mLSM悬浮液中加入10g土壤样品，混合后振荡一晚，然后静置一天以上。制成的土壤悬浮液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液5 mL与对数生长期的宿主菌菌液混合，在30℃，200 r/min下振荡12小时，然后用0.22 μm滤膜过滤其离心后的上清液，获得噬菌体原液。
用SM稀释噬菌体原液，按10倍倍比的浓度梯度分别稀释到101、102、103、104、105、106、107和108备用。取0.5 mL生长到对数期的病原菌菌液，混合到6 mL已冷却到55℃以下的半固体NA培养基，然后快速倒到NA固体培养基上，制备而成的双层平板经半固体层凝固后[22]，将其分区，分别点接之前稀释好的噬菌体原液各2 μL。在30℃下倒置培养12天，然后观察是否有噬菌斑出现。从出现的噬菌斑中挑取体积最大的一个，然后将其接入宿主菌菌液，摇匀并静置15 min后，在30℃，170 r/min下振荡12小时，经滤膜过滤后按上述步骤制成双层平板，继续重复这一操作35次以获得纯化的噬菌体。
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