阿尔茨海默病中Nogo-A及其受体的应用研究
Abstract：Nogo-Aisanimportantmyelinassociatedinhibitoryfactor,whichcreatesacriticalbarriertothecentralnervoussystemregenerationafterinjury.Recentresear 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com
chshowsthatNogo-A/Nogo-Areceptorscanaffectthemetabolismofamyloid-β-protein(Aβ),anditsdownstreamROCKkinase.ItcanmodulatethelevelofAβandtauprotein,aswellasthepermeabilityofbloodbrainbarrier.ThesefindingssuggestthatNogo-A/Nogo-AreceptorshaveacloserelationshipwithAlzheimer'sdisease(AD).Moreover,twonewreceptorsofNogo-A,PirBandS1PR2,havebeenidentifiedrecently.TheidentificationofthesetworeceptorsmayprovidenewinsightintothemechanismofNogo-Ainvolvingintheprogressofcentralnervousdiseases.wefocusesontheup-to-dateknowledgeofthebasicstructureandfunctionofNogo-A/Nogo-AreceptorsandtheirroleinADpathogenesis.Keyword：Nogo-A;Alzheimer'sdisease;Neurodegenerativedisease;Nogo-A是Nogo家族成员之一,是一种中枢神经系统特异性的轴突生长抑制物.近年来越来越多的研究发现,Nogo-A及其受体参与了突触可塑性的调节,并且还与β-淀粉样蛋白(amyloidbetapeptides,Aβ)代谢途径存在密切的相互作用,提示其在阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)中发挥了重要的作用.了解Nogo-A参与该病的机制可能会为治疗药物的开发提供新的思路.我们将对Nogo-A及其受体的基本结构和功能的最新进展,以及它们在阿尔茨海默病中的作用展开综述.1.Nogo-A及其受体的基本结构和功能1.1.Nogo-A的功能域与拓扑结构:Nogo-A是网状蛋白(reticulon,RTN)家族成员Nogo蛋白的3种亚型之一,由较长的N端片段及C端的网状蛋白同源结构域(reticulonhomologydomain,RHD)所组成(图1).目前其已知的功能片段有3个[1]:在RHD结构域的两个疏水片段之间,有1个特殊的结构域被称为Nogo-66,该结构域介导了Nogo对神经轴突生长的抑制作用;在N端由外显子3编码的片段当中,有1个区域称为Δ20,同样具有抑制神经轴突生长的作用,除此之外Δ20对于多种非神经细胞还具有抑制细胞黏附和迁移的作用;另外,Nogo-A与Nogo-B共有的N末端有1片段称为Δ2,该片段仅具有抑制细胞迁移的作用而对神经轴突生长无影响.1.2.Nogo-A受体及下游信号通路:Nogo-A可以与Nogo受体1(Nogoreceptor1,NgR1).2型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine1-phosphatereceptor2,S1PR2)和配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulinlikereceptorB,PirB)3种不同的受体结合,发挥其对神经元再生和可塑性的抑制作用.其中NgR1和PirB与Nogo-A的Nogo-66片段结合,而S1PR2则与其另一片段Δ20结合.图1Nogo-A结构示意图第1个被发现的Nogo受体是NgR1(又名Nogo-66受体或RTN-4受体).随后几年中,进一步发现还有两种髓鞘相关的NgR1的配体,即少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)和髓鞘相关糖蛋白(myelin-associateglycoprotein,MAG)[2].NgR1的球面结构的大部分是由富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat,LRR)构成的,N端和C端由富含半胱氨酸的模块覆盖.NgR1富含半胱氨酸的C端区域被认为是NgR1与其共受体p75神经营养素受体(p75neurotrophinreceptor,p75NTR)相互作用所必需[3].由于NgR1是一种GPI锚定膜蛋白,其整体均位于细胞膜的胞外侧,这就意味着它需要跨膜的共受体来向细胞内传递信号.NgR1的共受体包括p75NTR.含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(leucine-richrepeatandIgdomain-containingNogoreceptor-interactingprotein,Lingo-1).肿瘤坏死因子受体超家族19(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymemeber19,TNFRSF19),又称TROY(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilyexpressedonthemouseembryo)等[2].Nogo-A/NgR1介导的信号转导涉及鸟苷三磷酸酶(guanosinetriphosphatase,GTPase)Rho激酶(RasnomologgenefamilymemberA,RhoA).RhoA的激活是信号通路的主要汇合点,介导了神经生长锥的塌陷,并抑制神经元的再生和分化.在非活性状态时,Rho-GDP与鸟嘌呤解离抑制因子(Rho-GDPdisassociationinhibitor,Rho-GDI)结合.当配体与NgR1复合体结合后,p75NTR或TROY与Rho-GDI结合.释放Rho-GDP,Rho-GDP可以被鸟嘌呤核苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)激活为Rho-GTP[4].RhoA的活化使其可以与Rho相关激酶(Rho-associatedcoiled-coil-containingproteinkinase,ROCK)结合,进而导致ROCK的激活.ROCK可以磷酸化多种与细胞骨架调节作用相关的下游分子,包括LIM激酶1(LIM-domaincontainingproteinkinase1,LIMK1),肌球蛋白轻链2(myosinlightchain2,MLC2)和脑衰反应调节蛋白-2(collapsinresponsemediatorprotein2,CRMP2)等,分别产生纤维状肌动蛋白解聚.肌动球蛋白收缩及微管解聚等效应,最终导致生长锥塌陷和少突胶质细胞分化的抑制作用[5](图2).Atwal等[6]发现,小鼠配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulinlikereceptorB,PirB)是Nogo-66.MAG,和OMgp的另一种受体.PirB与人类白细胞免疫球蛋白样受体B2(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorB2,LILRB2)具有同源性.在免疫系统中,PirB可以作为主要组织相容性复合体Ⅰ类分子的受体[7].在中枢神经系统中,PirB介导的抑制性信号通路中存在着多种假说(图2).一般认为,Nogo-A与PirB结合导致PirB胞内段的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitionmotif,ITIM)发生磷酸化,磷酸化的ITIM招募含Src同源区2的蛋白质酪氨酸磷酸酶1/2(srchomology2-containingproteintyrosinephosphatase1/2,SHP1/2),导致下游的酪氨酸激酶受体B(tyrosinekinasereceptorB,TrkB)的去磷酸化以及磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/Akt通路的激活,继而通过RhoA.Cofilin最终导致F-actin的解聚[8].POSH(plentyofSH3)也参与了PirB的下游信号通路[9].POSH可以激活亮氨酸拉链激酶(leucinezipperkinase,LZK)和肌动蛋白-肌球蛋白调节蛋白Shroom3.最终,这两个信号通路均导致肌球蛋白ⅡA(myosinⅡA)的激活以及神经细胞的生长抑制作用.此外p75也可能参与了PirB的信号通路[10].Nogo-A的另一抑制性片段Δ20的受体直到最近才被确认为2型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine1-phosphatereceptor2,S1PR2)[11].S1PR2是S1PR亚家族的5种蛋白质之一.之前已知,S1PR2可以被低分子量脂质配体1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,S1P)激活,在多种类型的细胞中产生受体特异性的作用,包括细胞凋亡.细胞运动和细胞骨架动力学改变等.Kempf等[11]证实Δ20可以与S1PR2结合,并且结合位点不同于先前描述的的S1P结合位点.Δ20/S1PR2的下游信号一方面是通过G蛋白G13,白血病相关的Rho鸟苷酸交换因子(leukemia-associatedRhoguanineexchangefactor,LARG)和RhoA,另一方面,Δ20也可通过内吞作用进入神经元轴突内,并被反向转运至神经元胞体,进而通过下调磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylatedcAMPresponseelementbinding,pCREB)的水平,调节基因的转录,从而影响神经元的生长状态[12](图2).Nogo蛋白水平升高还可以使细胞内Ca2+水平升高[13],并影响整合素.蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC).哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR).信号转导与转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3)和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)等的活化[2].此外,高浓度的cAMP可以消除Nogo信号对体外培养的神经元突起生长的抑制作用[14],提示cAMP和RhoA信号通路可能有交汇.1.3.Nogo-A的表达与功能:成体时Nogo-A主要表达于少突胶质细胞的内质网,但是在髓鞘的最内层和最外层,Nogo-A也可以表达于少突胶质细胞的细胞表面[2].在神经系统发育过程中,神经元普遍高表达Nogo-A,但是在成体的神经细胞中Nogo-A的表达往往下调.然而,某些神经元即使在成体也有高水平的Nogo-A的表达[15,16],包括嗅球.海马的锥体细胞和中间神经元.脊髓运动神经元和背根神经节细胞等,这些神经元的特点是其突触连接的可塑性高,提示Nogo-A可能在调节突触可塑性中有一定的作用.Nogo-A最广为人知的功能是在中枢神经损伤修复过程中发挥轴突生长抑制作用.然而,越来越多的研究表明,Nogo-A在生理状态下对突触可塑性具有重要的调节作用,这与阿尔茨海默病的发病机制有着密切的联系.图2Nogo-A受体及下游信号通路首先,Nogo-A对于经验依赖可塑性(experiencedependentplasticity)具有明显的抑制作用.在中枢神经系统的许多区域,轴突的重排及生长在出生后的某一特定时间点(在大鼠和小鼠为3~5周)大幅减少,这一时间点恰好与这些区域中髓鞘形成的时间相重合.眼优势柱的可塑性即为一典型范例,在出生后早期(出生0~20d)阶段,通过单眼的视觉剥夺(如眼睑缝合),将会导致小鼠患侧的眼优势柱缩小,而健侧的眼优势柱相对扩大.在成年小鼠中,这一现象并不会发生,提示眼优势柱的可塑性存在着时间限制,即关键期.然而,在Nogo-A/B或NgR1基因敲除的小鼠中,眼优势柱的可塑性保持到了小鼠的成年阶段[17].同样,在NgR1敲除小鼠中,躯体感觉中枢的可塑性也维持到了关键期之后.进一步研究表明,一些在关键期内发生的改变如树突棘转换率的降低,在ngr1敲除小鼠中并没有发生[18].这些研究均提示,Nogo-A信号通路对经验依赖可塑性具有重要的调节作用,在发育过程中,随着髓鞘的形成,Nogo-A等髓鞘相关因子开始对经验依赖可塑性发挥抑制作用,从而导致关键期的截止.由于肌动蛋白在树突棘内高度集中形成细胞骨架,因此肌动蛋白被认为是调节树突棘形态学改变的信号通路的共同作用靶点,无论是Nogo-66还是Δ20均可以通过激活RhoA及其下游的ROCK导致肌动蛋白的解聚,因此Nogo-A可能是通过这一机制影响突触结构的可塑性,进而影响经验依赖可塑性.除了这一解释外,Jitsuki等[19]的研究表明,Nogo-A信号通路还通过抑制AMPAR受体向神经细胞膜的转运影响经验依赖可塑性,提示关键期内发生的多种改变可能都与Nogo-A等髓鞘相关的抑制因子有关.除了对经验依赖可塑性的影响外,Nogo-A对于突触传递的强度也有着重要的作用,包括对长时程增强(long-termpotentiation,LTP)的影响.Delekate等[20]发现,NgR1或Nogo-A中和抗体可以诱导海马脑片中LTP的增强,而基础突触传递和短时程突触可塑性没有受到影响.Nogo-A.NgR1或PirB的基因敲除对于LTP无明显影响[21],这可能是由于突变个体在发育过程中产生了代偿机制.NgR1敲除可以导致长时程抑制(long-termdepression,LTD)减弱[22].但Nogo-A敲除或抗体中和对于LTD均无影响[23].提示NgR1和Nogo-A在LTD方面有着不同的作用.近年来一些研究从行为学的角度进一步证实了Nogo-A对突触可塑性的抑制作用.Tews等[24]通过组成性表达的microRNA抑制大鼠中枢神经系统中Nogo-A表达,发现海马和运动皮层中LTP增强.此外,他们还通过行为学研究证实了Nogo-A敲除大鼠存在认知功能的缺陷.Zemmar等[25]研究了Nogo-A抗体对大鼠运动学习的影响,发现接受Nogo-A抗体处理的大鼠在任务中的表现明显优于对照组.Karlen等[22]发现,过表达NgR1的小鼠长时记忆的形成受损,提示NgR1的下调可能在长时程记忆的形成具有重要意义.2.Nogo-A及其受体在阿尔茨海默病中的作用2.1.Nogo-A在阿尔茨海默病中的作用2.1.1.RTN家族蛋白与BACE1的相互作用:Aβ的产生被认为是AD的始动因素,而该过程是由β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(beta-siteamyloidprecursorprotein-cleavingenzyme1,BACE-1)所启动的.因此,AD的进展与BACE-1的活性有着密切的关系.如上所述,Nogo蛋白是网状蛋白家族成员之一,即RTN4.实际上,人类的全部4种网状蛋白似乎都参与了AD的发病过程,He等[26]首先发现,BACE1与RTN1.RTN2.RTN3和RTN4发生免疫共沉淀.由于He等观察到BACE1与RTN3在神经元内共存,因此认为RTN3更可能与大脑的Aβ产生相关.上述研究还证实了在体外过表达RTN3可以降低HEK-293细胞的Aβ水平,相反,通过RNA干扰敲除RTN3可以增加Aβ水平,这与RTN3抑制BACE1的观点相符.He等[27]通过诱导突变的方法进一步确定了RTN和BACE1相互作用的结构域,发现在哺乳动物RTN家族中完全保守的位于C-末端尾部的QID三氨基酸序列对于相互作用是必需的.但随后Kume等[28]的研究得出了相反的结果,Kume等同样利用诱导突变的方法,发现缺少C末端序列的RTN3和RTN4可以结合并抑制BACE1的活性,并且还利用秀丽隐杆线虫的RTN蛋白实现了对BACE1的抑制,缺少C末端的RTN不具有QID序列,秀丽隐杆线虫的RTN只有AID而无QID序列,这都说明QID序列非相互作用所必需.因此,目前RTN家族蛋白与Aβ相互作用的机制仍存在争议.Shi等[29]从细胞内BACE1运输的角度提出了另一个解释.Shi等的研究表明,过表达RTN3可以导致更多的BACE1保留在内质网内,减少BACE1向高尔基体的运输.这种改变可能的原因是,RTN3在内质网中的运输较慢,而RTN3和BACE1之间的相互作用导致BACE1滞留在内质网内.内质网的pH环境并不适宜BACE1发挥作用,导致其酶活性下降,并且还有可能增加BACE1的降解.另一方面,RTN3本身也可以积累形成聚集体,并且RTN3聚集与AD患者脑中的RTN3免疫反应性营养不良轴突(reticulon3immunoreactivedystrophicneurites,RIDN)相关[30].单独过表达RTN3的转基因小鼠在特定脑区(如海马CA1区)出现了RIDN,而这种RTN3免疫反应性营养不良轴突也存在于人类的AD患者和表达APP突变基因的小鼠脑中.此外,过表达RTN3对于海马CA1区淀粉样蛋白沉积的减少作用不明显,而此区也是RTN3聚集体形成的主要部位[30].因此,RTN3聚集体的形成很可能导致了RTN3对于BACE1抑制作用的消失.这一研究表明,抑制RTN3的聚集作用不仅可以减少RIDN的形成,也有利于减少淀粉样蛋白的沉积.2.1.2.Nogo-A在AD中的作用:Nogo-A(RTN-4A)与RTN3类似,也具有RHD结构域.理论上Nogo-A同样可以与BACE1发挥相互作用而抑制Aβ的产生,但是目前的研究却普遍支持Nogo-A对AD的发病有促进作用.Masliah等[31]发现,Nogo基因敲除可以改善APP转基因小鼠在疾病的早期和中期的学习记忆障碍.此外,Nogo基因敲除可以使得一些轴突生长标记物的表达水平得到恢复,包括突触素.微管相关蛋白2.生长相关蛋白43和神经丝蛋白等.Prior等[32]的研究发现,Nogo-P4(即Nogo-66活性片段)可以抑制轴突生长,同时使得皮层神经元Aβ42水平增加,从而导致具有神经毒性的Aβ42的积累,进一步损伤神经轴突的生长.Nogo-P4激活NgR至少可以通过两种下游信号分子调节Aβ42的分泌,ROCK和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC).ROCK的激活可能会导致Aβ42的增加,而PKC的激活可能导致Aβ42的减少[33].这两种效应可能会相互抵消,因此,Nogo-P4可能还通过其他未知的通路影响Aβ42的分泌.关于AD的研究表明,突触的活动是调节Aβ水平最重要的因素之一[34],同时突触可塑性的改变也是AD的重要特征.如上所述,Nogo-A/NgR1信号通路对突触可塑性及小鼠的学习和记忆能力有着重要的影响.因此目前认为,Nogo-A可能通过影响Aβ的代谢以及抑制突触的可塑性触发AD的发生和发展.2.2.NgR在阿尔茨海默病中的作用:NgR是NogoA.OMgp.MAG共同的受体,其信号通路在抑制轴突再生中发挥了重要作用.近年来研究表明,NgR1可能通过影响淀粉样蛋白前体(amyloidprecursorprotein,APP)的代谢参与了AD的病理过程.Park等[35]通过免疫共沉淀实验首先发现APP和Aβ可以与NgR发生相互作用.在AD患者脑中,神经元的NgR定位发生改变,神经元NgR表达从胞体转移而主要集中在淀粉样斑块中.在体外实验中,内源性NgR/APP/Aβ相互作用能抑制Aβ的产生和Aβ斑块的沉积.通过NgR基因打靶或注射可溶性NgR片段可以调节转基因小鼠大脑内的Aβ水平.NgR的水平与Aβ水平.斑块沉积和神经营养不良之间成负相关.在随后的研究中,Park等通过定点突变,进一步发现Aβ中央的15-28氨基酸残基可以与NgR凹面的口袋结构结合,而此结合位点不同于Nogo-66的结合位点.以往的研究表明,通过外周应用Aβ的结合剂可以减少中枢的Aβ水平,称为Aβ的外周沉没假说[36].Park等[37]通过实验证实,皮下注射NgR(310)ecto-Fc可以使AD小鼠模型脑中的斑块沉积减少,并且改善转基因小鼠在水迷宫任务中的短期记忆.由于NgR(310)ecto-Fc不易通过血脑屏障,副作用较小,因此皮下注射NgR(310)ecto-Fc可能是AD治疗的一个较为安全有效的方案.最近的一项研究对于NgR在体内的作用又提出了不同的观点.在Zhou等[38]的研究中,NgR通过与APP的相互作用调节Aβ的产生,尽管对于NgR和APP之间物理相互作用的研究结果与Park等一致,但这种相互作用对Aβ产生的影响与其存在分歧.Zhou等认为,NgR和APP之间的相互作用减少了APP在细胞表面的表达,并有助于BACE1对APP酶切作用,敲除Nogo受体基因特别是NgR2基因使AD转基因小鼠淀粉样沉积减少.上述结果可以确定,NgR蛋白能够调节APP的代谢,但是NgR在Aβ产生中的确切作用仍需进一步研究.2.3.PirB在AD中的作用:最近的一项研究证实,小鼠的PirB及其在人类的同源物LilrB2均可作为Aβ42寡聚体的受体[39],PirB和LilrB2第1和第2个胞外免疫球蛋白(Ig)结构域介导了这种相互作用,从而增强Cofilin信号,并介导了Aβ引起的海马神经元LTP的消失,并参与了AD小鼠记忆障碍的形成.由于Nogo-A也是PirB及LilrB2的配体,因此Nogo-A有可能通过PirB和LilrB2参与AD的发病.2.4.Nogo-A受体后信号通路在AD中的作用:尽管Nogo-A可以与NgR1.S1PR2和PirB3种不同的受体结合,但是RhoA的激活是这3条信号通路的主要汇合点.并且,许多研究表明,RhoA/ROCK通路参与了AD的进展.Zhou等[40]的研究表明,非甾体类抗炎药可以通过抑制ROCK的活性,减少动物和细胞模型中Aβ的水平.随后,Pedrini等[41]结果表明,他汀类药物也可以用抑制ROCK来减少Aβ的产生.这些研究结果均提示,抑制ROCK通路对抑制Aβ的产生具有重要意义.ROCK激酶具有两种亚型,包括ROCK1和ROCK2,两者的激酶结构域具有92%的同源性,主要的不同在于它们的亚细胞定位[42].Herskowitiz等[43]在细胞和动物模型中证实了抑制ROCK2可以导致Aβ的产生减少.Henderson等[44]的研究表明,ROCK2或ROCK1的下调均可降低神经元中的Aβ水平,Hu等[45]进一步证实,ROCK激酶影响Aβ水平可能是通过影响细胞自噬及APP的降解.最近一些研究揭示了ROCK激酶参与AD发病的新的机制.通过RNAi敲减人类神经母细胞瘤细胞中的ROCK1或ROCK2均能刺激自噬减少内源性tau蛋白的产生[46].膜联蛋白A1(annexinA1)通过对RhoA-ROCK信号通路的抑制作用可以恢复Aβ1-42诱导的血脑屏障的破坏[47].这些研究提示,ROCK激酶可以通过多种途径影响AD的发病过程.3.结语Nogo-A及其受体在AD的发病过程中扮演重要的角色,其内在的机制包括以下几个关键过程.首先,Nogo-A与BACE1之间,以及NgR与APP和Aβ之间的相互作用可以影响淀粉样蛋白在神经细胞内的代谢;其次,Nogo-A及其下游的RhoA-ROCK通路还可能通过其经典的抑制轴突生长和突触重塑的作用,阻断受损神经的网络恢复,导致AD的恶化;此外,ROCK激酶的两种亚型的激活,能够影响Aβ.tau蛋白的水平以及血脑屏障的通透性,通过多种途径参与AD的发病.近年还发现了Nogo-A的另外两个受体PirB和S1PR2,它们在AD中的作用尚在研究当中.近年,Nogo-A及其受体在中枢神经系统损伤再生中的作用一直是神经科学研究领域的热点,Nogo-A在许多神经系统退行性疾病当中都发挥了相当重要的作用,一些针对Nogo-A信号通路的药物也进入了临床试验阶段.随着研究的深入,靶向Nogo-A及其受体的药物将会在中枢神经系统疾病的临床治疗中发挥更重要的作用.
chshowsthatNogo-A/Nogo-Areceptorscanaffectthemetabolismofamyloid-β-protein(Aβ),anditsdownstreamROCKkinase.ItcanmodulatethelevelofAβandtauprotein,aswellasthepermeabilityofbloodbrainbarrier.ThesefindingssuggestthatNogo-A/Nogo-AreceptorshaveacloserelationshipwithAlzheimer'sdisease(AD).Moreover,twonewreceptorsofNogo-A,PirBandS1PR2,havebeenidentifiedrecently.TheidentificationofthesetworeceptorsmayprovidenewinsightintothemechanismofNogo-Ainvolvingintheprogressofcentralnervousdiseases.wefocusesontheup-to-dateknowledgeofthebasicstructureandfunctionofNogo-A/Nogo-AreceptorsandtheirroleinADpathogenesis.Keyword：Nogo-A;Alzheimer'sdisease;Neurodegenerativedisease;Nogo-A是Nogo家族成员之一,是一种中枢神经系统特异性的轴突生长抑制物.近年来越来越多的研究发现,Nogo-A及其受体参与了突触可塑性的调节,并且还与β-淀粉样蛋白(amyloidbetapeptides,Aβ)代谢途径存在密切的相互作用,提示其在阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)中发挥了重要的作用.了解Nogo-A参与该病的机制可能会为治疗药物的开发提供新的思路.我们将对Nogo-A及其受体的基本结构和功能的最新进展,以及它们在阿尔茨海默病中的作用展开综述.1.Nogo-A及其受体的基本结构和功能1.1.Nogo-A的功能域与拓扑结构:Nogo-A是网状蛋白(reticulon,RTN)家族成员Nogo蛋白的3种亚型之一,由较长的N端片段及C端的网状蛋白同源结构域(reticulonhomologydomain,RHD)所组成(图1).目前其已知的功能片段有3个[1]:在RHD结构域的两个疏水片段之间,有1个特殊的结构域被称为Nogo-66,该结构域介导了Nogo对神经轴突生长的抑制作用;在N端由外显子3编码的片段当中,有1个区域称为Δ20,同样具有抑制神经轴突生长的作用,除此之外Δ20对于多种非神经细胞还具有抑制细胞黏附和迁移的作用;另外,Nogo-A与Nogo-B共有的N末端有1片段称为Δ2,该片段仅具有抑制细胞迁移的作用而对神经轴突生长无影响.1.2.Nogo-A受体及下游信号通路:Nogo-A可以与Nogo受体1(Nogoreceptor1,NgR1).2型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine1-phosphatereceptor2,S1PR2)和配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulinlikereceptorB,PirB)3种不同的受体结合,发挥其对神经元再生和可塑性的抑制作用.其中NgR1和PirB与Nogo-A的Nogo-66片段结合,而S1PR2则与其另一片段Δ20结合.图1Nogo-A结构示意图第1个被发现的Nogo受体是NgR1(又名Nogo-66受体或RTN-4受体).随后几年中,进一步发现还有两种髓鞘相关的NgR1的配体,即少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)和髓鞘相关糖蛋白(myelin-associateglycoprotein,MAG)[2].NgR1的球面结构的大部分是由富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat,LRR)构成的,N端和C端由富含半胱氨酸的模块覆盖.NgR1富含半胱氨酸的C端区域被认为是NgR1与其共受体p75神经营养素受体(p75neurotrophinreceptor,p75NTR)相互作用所必需[3].由于NgR1是一种GPI锚定膜蛋白,其整体均位于细胞膜的胞外侧,这就意味着它需要跨膜的共受体来向细胞内传递信号.NgR1的共受体包括p75NTR.含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(leucine-richrepeatandIgdomain-containingNogoreceptor-interactingprotein,Lingo-1).肿瘤坏死因子受体超家族19(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymemeber19,TNFRSF19),又称TROY(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilyexpressedonthemouseembryo)等[2].Nogo-A/NgR1介导的信号转导涉及鸟苷三磷酸酶(guanosinetriphosphatase,GTPase)Rho激酶(RasnomologgenefamilymemberA,RhoA).RhoA的激活是信号通路的主要汇合点,介导了神经生长锥的塌陷,并抑制神经元的再生和分化.在非活性状态时,Rho-GDP与鸟嘌呤解离抑制因子(Rho-GDPdisassociationinhibitor,Rho-GDI)结合.当配体与NgR1复合体结合后,p75NTR或TROY与Rho-GDI结合.释放Rho-GDP,Rho-GDP可以被鸟嘌呤核苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)激活为Rho-GTP[4].RhoA的活化使其可以与Rho相关激酶(Rho-associatedcoiled-coil-containingproteinkinase,ROCK)结合,进而导致ROCK的激活.ROCK可以磷酸化多种与细胞骨架调节作用相关的下游分子,包括LIM激酶1(LIM-domaincontainingproteinkinase1,LIMK1),肌球蛋白轻链2(myosinlightchain2,MLC2)和脑衰反应调节蛋白-2(collapsinresponsemediatorprotein2,CRMP2)等,分别产生纤维状肌动蛋白解聚.肌动球蛋白收缩及微管解聚等效应,最终导致生长锥塌陷和少突胶质细胞分化的抑制作用[5](图2).Atwal等[6]发现,小鼠配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulinlikereceptorB,PirB)是Nogo-66.MAG,和OMgp的另一种受体.PirB与人类白细胞免疫球蛋白样受体B2(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorB2,LILRB2)具有同源性.在免疫系统中,PirB可以作为主要组织相容性复合体Ⅰ类分子的受体[7].在中枢神经系统中,PirB介导的抑制性信号通路中存在着多种假说(图2).一般认为,Nogo-A与PirB结合导致PirB胞内段的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitionmotif,ITIM)发生磷酸化,磷酸化的ITIM招募含Src同源区2的蛋白质酪氨酸磷酸酶1/2(srchomology2-containingproteintyrosinephosphatase1/2,SHP1/2),导致下游的酪氨酸激酶受体B(tyrosinekinasereceptorB,TrkB)的去磷酸化以及磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/Akt通路的激活,继而通过RhoA.Cofilin最终导致F-actin的解聚[8].POSH(plentyofSH3)也参与了PirB的下游信号通路[9].POSH可以激活亮氨酸拉链激酶(leucinezipperkinase,LZK)和肌动蛋白-肌球蛋白调节蛋白Shroom3.最终,这两个信号通路均导致肌球蛋白ⅡA(myosinⅡA)的激活以及神经细胞的生长抑制作用.此外p75也可能参与了PirB的信号通路[10].Nogo-A的另一抑制性片段Δ20的受体直到最近才被确认为2型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine1-phosphatereceptor2,S1PR2)[11].S1PR2是S1PR亚家族的5种蛋白质之一.之前已知,S1PR2可以被低分子量脂质配体1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,S1P)激活,在多种类型的细胞中产生受体特异性的作用,包括细胞凋亡.细胞运动和细胞骨架动力学改变等.Kempf等[11]证实Δ20可以与S1PR2结合,并且结合位点不同于先前描述的的S1P结合位点.Δ20/S1PR2的下游信号一方面是通过G蛋白G13,白血病相关的Rho鸟苷酸交换因子(leukemia-associatedRhoguanineexchangefactor,LARG)和RhoA,另一方面,Δ20也可通过内吞作用进入神经元轴突内,并被反向转运至神经元胞体,进而通过下调磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylatedcAMPresponseelementbinding,pCREB)的水平,调节基因的转录,从而影响神经元的生长状态[12](图2).Nogo蛋白水平升高还可以使细胞内Ca2+水平升高[13],并影响整合素.蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC).哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR).信号转导与转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3)和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)等的活化[2].此外,高浓度的cAMP可以消除Nogo信号对体外培养的神经元突起生长的抑制作用[14],提示cAMP和RhoA信号通路可能有交汇.1.3.Nogo-A的表达与功能:成体时Nogo-A主要表达于少突胶质细胞的内质网,但是在髓鞘的最内层和最外层,Nogo-A也可以表达于少突胶质细胞的细胞表面[2].在神经系统发育过程中,神经元普遍高表达Nogo-A,但是在成体的神经细胞中Nogo-A的表达往往下调.然而,某些神经元即使在成体也有高水平的Nogo-A的表达[15,16],包括嗅球.海马的锥体细胞和中间神经元.脊髓运动神经元和背根神经节细胞等,这些神经元的特点是其突触连接的可塑性高,提示Nogo-A可能在调节突触可塑性中有一定的作用.Nogo-A最广为人知的功能是在中枢神经损伤修复过程中发挥轴突生长抑制作用.然而,越来越多的研究表明,Nogo-A在生理状态下对突触可塑性具有重要的调节作用,这与阿尔茨海默病的发病机制有着密切的联系.图2Nogo-A受体及下游信号通路首先,Nogo-A对于经验依赖可塑性(experiencedependentplasticity)具有明显的抑制作用.在中枢神经系统的许多区域,轴突的重排及生长在出生后的某一特定时间点(在大鼠和小鼠为3~5周)大幅减少,这一时间点恰好与这些区域中髓鞘形成的时间相重合.眼优势柱的可塑性即为一典型范例,在出生后早期(出生0~20d)阶段,通过单眼的视觉剥夺(如眼睑缝合),将会导致小鼠患侧的眼优势柱缩小,而健侧的眼优势柱相对扩大.在成年小鼠中,这一现象并不会发生,提示眼优势柱的可塑性存在着时间限制,即关键期.然而,在Nogo-A/B或NgR1基因敲除的小鼠中,眼优势柱的可塑性保持到了小鼠的成年阶段[17].同样,在NgR1敲除小鼠中,躯体感觉中枢的可塑性也维持到了关键期之后.进一步研究表明,一些在关键期内发生的改变如树突棘转换率的降低,在ngr1敲除小鼠中并没有发生[18].这些研究均提示,Nogo-A信号通路对经验依赖可塑性具有重要的调节作用,在发育过程中,随着髓鞘的形成,Nogo-A等髓鞘相关因子开始对经验依赖可塑性发挥抑制作用,从而导致关键期的截止.由于肌动蛋白在树突棘内高度集中形成细胞骨架,因此肌动蛋白被认为是调节树突棘形态学改变的信号通路的共同作用靶点,无论是Nogo-66还是Δ20均可以通过激活RhoA及其下游的ROCK导致肌动蛋白的解聚,因此Nogo-A可能是通过这一机制影响突触结构的可塑性,进而影响经验依赖可塑性.除了这一解释外,Jitsuki等[19]的研究表明,Nogo-A信号通路还通过抑制AMPAR受体向神经细胞膜的转运影响经验依赖可塑性,提示关键期内发生的多种改变可能都与Nogo-A等髓鞘相关的抑制因子有关.除了对经验依赖可塑性的影响外,Nogo-A对于突触传递的强度也有着重要的作用,包括对长时程增强(long-termpotentiation,LTP)的影响.Delekate等[20]发现,NgR1或Nogo-A中和抗体可以诱导海马脑片中LTP的增强,而基础突触传递和短时程突触可塑性没有受到影响.Nogo-A.NgR1或PirB的基因敲除对于LTP无明显影响[21],这可能是由于突变个体在发育过程中产生了代偿机制.NgR1敲除可以导致长时程抑制(long-termdepression,LTD)减弱[22].但Nogo-A敲除或抗体中和对于LTD均无影响[23].提示NgR1和Nogo-A在LTD方面有着不同的作用.近年来一些研究从行为学的角度进一步证实了Nogo-A对突触可塑性的抑制作用.Tews等[24]通过组成性表达的microRNA抑制大鼠中枢神经系统中Nogo-A表达,发现海马和运动皮层中LTP增强.此外,他们还通过行为学研究证实了Nogo-A敲除大鼠存在认知功能的缺陷.Zemmar等[25]研究了Nogo-A抗体对大鼠运动学习的影响,发现接受Nogo-A抗体处理的大鼠在任务中的表现明显优于对照组.Karlen等[22]发现,过表达NgR1的小鼠长时记忆的形成受损,提示NgR1的下调可能在长时程记忆的形成具有重要意义.2.Nogo-A及其受体在阿尔茨海默病中的作用2.1.Nogo-A在阿尔茨海默病中的作用2.1.1.RTN家族蛋白与BACE1的相互作用:Aβ的产生被认为是AD的始动因素,而该过程是由β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(beta-siteamyloidprecursorprotein-cleavingenzyme1,BACE-1)所启动的.因此,AD的进展与BACE-1的活性有着密切的关系.如上所述,Nogo蛋白是网状蛋白家族成员之一,即RTN4.实际上,人类的全部4种网状蛋白似乎都参与了AD的发病过程,He等[26]首先发现,BACE1与RTN1.RTN2.RTN3和RTN4发生免疫共沉淀.由于He等观察到BACE1与RTN3在神经元内共存,因此认为RTN3更可能与大脑的Aβ产生相关.上述研究还证实了在体外过表达RTN3可以降低HEK-293细胞的Aβ水平,相反,通过RNA干扰敲除RTN3可以增加Aβ水平,这与RTN3抑制BACE1的观点相符.He等[27]通过诱导突变的方法进一步确定了RTN和BACE1相互作用的结构域,发现在哺乳动物RTN家族中完全保守的位于C-末端尾部的QID三氨基酸序列对于相互作用是必需的.但随后Kume等[28]的研究得出了相反的结果,Kume等同样利用诱导突变的方法,发现缺少C末端序列的RTN3和RTN4可以结合并抑制BACE1的活性,并且还利用秀丽隐杆线虫的RTN蛋白实现了对BACE1的抑制,缺少C末端的RTN不具有QID序列,秀丽隐杆线虫的RTN只有AID而无QID序列,这都说明QID序列非相互作用所必需.因此,目前RTN家族蛋白与Aβ相互作用的机制仍存在争议.Shi等[29]从细胞内BACE1运输的角度提出了另一个解释.Shi等的研究表明,过表达RTN3可以导致更多的BACE1保留在内质网内,减少BACE1向高尔基体的运输.这种改变可能的原因是,RTN3在内质网中的运输较慢,而RTN3和BACE1之间的相互作用导致BACE1滞留在内质网内.内质网的pH环境并不适宜BACE1发挥作用,导致其酶活性下降,并且还有可能增加BACE1的降解.另一方面,RTN3本身也可以积累形成聚集体,并且RTN3聚集与AD患者脑中的RTN3免疫反应性营养不良轴突(reticulon3immunoreactivedystrophicneurites,RIDN)相关[30].单独过表达RTN3的转基因小鼠在特定脑区(如海马CA1区)出现了RIDN,而这种RTN3免疫反应性营养不良轴突也存在于人类的AD患者和表达APP突变基因的小鼠脑中.此外,过表达RTN3对于海马CA1区淀粉样蛋白沉积的减少作用不明显,而此区也是RTN3聚集体形成的主要部位[30].因此,RTN3聚集体的形成很可能导致了RTN3对于BACE1抑制作用的消失.这一研究表明,抑制RTN3的聚集作用不仅可以减少RIDN的形成,也有利于减少淀粉样蛋白的沉积.2.1.2.Nogo-A在AD中的作用:Nogo-A(RTN-4A)与RTN3类似,也具有RHD结构域.理论上Nogo-A同样可以与BACE1发挥相互作用而抑制Aβ的产生,但是目前的研究却普遍支持Nogo-A对AD的发病有促进作用.Masliah等[31]发现,Nogo基因敲除可以改善APP转基因小鼠在疾病的早期和中期的学习记忆障碍.此外,Nogo基因敲除可以使得一些轴突生长标记物的表达水平得到恢复,包括突触素.微管相关蛋白2.生长相关蛋白43和神经丝蛋白等.Prior等[32]的研究发现,Nogo-P4(即Nogo-66活性片段)可以抑制轴突生长,同时使得皮层神经元Aβ42水平增加,从而导致具有神经毒性的Aβ42的积累,进一步损伤神经轴突的生长.Nogo-P4激活NgR至少可以通过两种下游信号分子调节Aβ42的分泌,ROCK和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC).ROCK的激活可能会导致Aβ42的增加,而PKC的激活可能导致Aβ42的减少[33].这两种效应可能会相互抵消,因此,Nogo-P4可能还通过其他未知的通路影响Aβ42的分泌.关于AD的研究表明,突触的活动是调节Aβ水平最重要的因素之一[34],同时突触可塑性的改变也是AD的重要特征.如上所述,Nogo-A/NgR1信号通路对突触可塑性及小鼠的学习和记忆能力有着重要的影响.因此目前认为,Nogo-A可能通过影响Aβ的代谢以及抑制突触的可塑性触发AD的发生和发展.2.2.NgR在阿尔茨海默病中的作用:NgR是NogoA.OMgp.MAG共同的受体,其信号通路在抑制轴突再生中发挥了重要作用.近年来研究表明,NgR1可能通过影响淀粉样蛋白前体(amyloidprecursorprotein,APP)的代谢参与了AD的病理过程.Park等[35]通过免疫共沉淀实验首先发现APP和Aβ可以与NgR发生相互作用.在AD患者脑中,神经元的NgR定位发生改变,神经元NgR表达从胞体转移而主要集中在淀粉样斑块中.在体外实验中,内源性NgR/APP/Aβ相互作用能抑制Aβ的产生和Aβ斑块的沉积.通过NgR基因打靶或注射可溶性NgR片段可以调节转基因小鼠大脑内的Aβ水平.NgR的水平与Aβ水平.斑块沉积和神经营养不良之间成负相关.在随后的研究中,Park等通过定点突变,进一步发现Aβ中央的15-28氨基酸残基可以与NgR凹面的口袋结构结合,而此结合位点不同于Nogo-66的结合位点.以往的研究表明,通过外周应用Aβ的结合剂可以减少中枢的Aβ水平,称为Aβ的外周沉没假说[36].Park等[37]通过实验证实,皮下注射NgR(310)ecto-Fc可以使AD小鼠模型脑中的斑块沉积减少,并且改善转基因小鼠在水迷宫任务中的短期记忆.由于NgR(310)ecto-Fc不易通过血脑屏障,副作用较小,因此皮下注射NgR(310)ecto-Fc可能是AD治疗的一个较为安全有效的方案.最近的一项研究对于NgR在体内的作用又提出了不同的观点.在Zhou等[38]的研究中,NgR通过与APP的相互作用调节Aβ的产生,尽管对于NgR和APP之间物理相互作用的研究结果与Park等一致,但这种相互作用对Aβ产生的影响与其存在分歧.Zhou等认为,NgR和APP之间的相互作用减少了APP在细胞表面的表达,并有助于BACE1对APP酶切作用,敲除Nogo受体基因特别是NgR2基因使AD转基因小鼠淀粉样沉积减少.上述结果可以确定,NgR蛋白能够调节APP的代谢,但是NgR在Aβ产生中的确切作用仍需进一步研究.2.3.PirB在AD中的作用:最近的一项研究证实,小鼠的PirB及其在人类的同源物LilrB2均可作为Aβ42寡聚体的受体[39],PirB和LilrB2第1和第2个胞外免疫球蛋白(Ig)结构域介导了这种相互作用,从而增强Cofilin信号,并介导了Aβ引起的海马神经元LTP的消失,并参与了AD小鼠记忆障碍的形成.由于Nogo-A也是PirB及LilrB2的配体,因此Nogo-A有可能通过PirB和LilrB2参与AD的发病.2.4.Nogo-A受体后信号通路在AD中的作用:尽管Nogo-A可以与NgR1.S1PR2和PirB3种不同的受体结合,但是RhoA的激活是这3条信号通路的主要汇合点.并且,许多研究表明,RhoA/ROCK通路参与了AD的进展.Zhou等[40]的研究表明,非甾体类抗炎药可以通过抑制ROCK的活性,减少动物和细胞模型中Aβ的水平.随后,Pedrini等[41]结果表明,他汀类药物也可以用抑制ROCK来减少Aβ的产生.这些研究结果均提示,抑制ROCK通路对抑制Aβ的产生具有重要意义.ROCK激酶具有两种亚型,包括ROCK1和ROCK2,两者的激酶结构域具有92%的同源性,主要的不同在于它们的亚细胞定位[42].Herskowitiz等[43]在细胞和动物模型中证实了抑制ROCK2可以导致Aβ的产生减少.Henderson等[44]的研究表明,ROCK2或ROCK1的下调均可降低神经元中的Aβ水平,Hu等[45]进一步证实,ROCK激酶影响Aβ水平可能是通过影响细胞自噬及APP的降解.最近一些研究揭示了ROCK激酶参与AD发病的新的机制.通过RNAi敲减人类神经母细胞瘤细胞中的ROCK1或ROCK2均能刺激自噬减少内源性tau蛋白的产生[46].膜联蛋白A1(annexinA1)通过对RhoA-ROCK信号通路的抑制作用可以恢复Aβ1-42诱导的血脑屏障的破坏[47].这些研究提示,ROCK激酶可以通过多种途径影响AD的发病过程.3.结语Nogo-A及其受体在AD的发病过程中扮演重要的角色,其内在的机制包括以下几个关键过程.首先,Nogo-A与BACE1之间,以及NgR与APP和Aβ之间的相互作用可以影响淀粉样蛋白在神经细胞内的代谢;其次,Nogo-A及其下游的RhoA-ROCK通路还可能通过其经典的抑制轴突生长和突触重塑的作用,阻断受损神经的网络恢复,导致AD的恶化;此外,ROCK激酶的两种亚型的激活,能够影响Aβ.tau蛋白的水平以及血脑屏障的通透性,通过多种途径参与AD的发病.近年还发现了Nogo-A的另外两个受体PirB和S1PR2,它们在AD中的作用尚在研究当中.近年,Nogo-A及其受体在中枢神经系统损伤再生中的作用一直是神经科学研究领域的热点,Nogo-A在许多神经系统退行性疾病当中都发挥了相当重要的作用,一些针对Nogo-A信号通路的药物也进入了临床试验阶段.随着研究的深入,靶向Nogo-A及其受体的药物将会在中枢神经系统疾病的临床治疗中发挥更重要的作用.
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