增强型35s启动子在菊花转化中的应用
本实验以GUS作为报告基因，通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因和增强型35S启动子的表达载体pORER1-2×35S:GUS转入菊花脑、菊花‘神马’和‘优香’叶片中，探讨在增强型35S启动子的作用下，种源、叶片位置等因素对基因表达效果的影响。结果表明菊花品种‘优香’的瞬时转化率最高，为76.67%，表达效率也最佳；菊花脑的转化率最低，为60.0%，表达效率较差，部分叶片枯死；瞬时转化注射叶片选择第4片全部展开叶为宜。该体系的建立为在菊花叶片中基因功能的分析提供了有效手段，并以此为基础为进一步获得高效稳定的转基因菊花奠定了良好基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2载体与菌液2
1.2试剂与仪器 2
1.2.1试剂2
1.2.2仪器设备2
1.3试验方法3
1.3.1农杆菌介导法瞬时转化材料叶片3
1.3.2化学染色法检测筛选瞬时转化叶片中GUS表达4
1.3.3瞬时转化叶片的分子鉴定4
2结果与分析6
2.1瞬时转化材料选择6
2.2 pORE R12×35S:GUS瞬时转化植物叶片6
2.2.1瞬时转化后植物叶面表现6
2.2.2化学染色法检测转化叶片中GUS瞬时表达 7
2.2.3叶片中GUS瞬时表达RTPCR验证8
3讨论 9
（略）
致谢9
参考文献10
注：1. 目次中的内容一般列出“章”、“节”、“条”三级标题即可；
2．X、Y表示具体的阿拉伯数字；
增强型35S启动子在菊花转化中的应用
引言
菊花( Chrysanthemum morifolium Ramat.)，原产中国，是中国十大名花之一，同时也是世界四大切花之一，其观赏价值高，近年来在绿化美化中的应用越来越多，急需加大菊花品种选育及创新工 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
作的进度[1,2]。转基因技术的出现为菊花育种提供了全新的思路和途径。随着研究的进行，发现由于菊花遗传背景的复杂性，大量的外源基因在菊花中没有获得预期表达，传统的遗传转化方法在菊花中的应用受到较大的限制[3]。根癌农杆菌介导转基因技术在菊花中进行表达存在转化效率低、外源基因表达量低、嵌合体株率高及再生过程中基因沉默等问题；外植体的选择、抗生素的确定、易感菌株的选用、共培养条件等对转化效率起着决定性作用，且存在操作繁琐、周期长的问题，通常需要4～6个月，综合菊花转基因的成功案例中不同菌株的使用情况，遗传转化率低下，一般在5～40%[4,5]。CaMV 35S启动子在菊花中的转基因表达水平相对较低[6,7]。用无翻译增强子的CaMV 35S启动子驱动GUS基因瞬时表达，化学染色法检测GUS表达肉眼不可见蓝色[8]。为了进一步提高转入的外源目的基因在菊花中的表达水平，人们对35S启动子进行过多种改变，如将其343～90区域作顺向重复排列构成的35S双启动子2×35S便是成功的尝试[9,10]。农杆菌介导的瞬时表达方法是近年来发展形成的一种快速有效的分析蛋白质表达的方法，与传统的转基因过程相比较，具有周期短、安全高效、操作简易、费用相对较低、转化效率高、能同时感染多个品种的优点[11,12]。目前该方法已经在许多植物组织中取得了成功，但是在菊花中该方法还少见报道。
本试验提供一种将外源基因转入菊花中进行瞬时表达的方法，以农杆菌介导，2×35S为启动子，通过构建的植物表达载体pORE R12×35S:GUS，使外源基因GUS在菊花及菊花脑中进行瞬时表达，填补了目前农杆菌介导的瞬时表达在菊花中的空白，该体系的建立为在菊花叶片中基因功能的分析提供了有效手段，并以此为基础为进一步获得高效稳定的转基因菊花奠定了良好基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
供试材料为大学“中国菊花品种资源保存中心”保存的菊花脑(Chrysanthemum?nankingense)和2份切花菊品种‘神马’（Chrysanthemum morifolium Ramat. ‘Jinba’）、‘优香’（Chrysanthemum morifolium Ramat. ‘Youxiang’）。
1．1．2 载体和菌液
pORE R1（空载）[13]（购自TAIR）；载体pORE R12×35S:GUS由本实验室师兄宋爱萍构建，设计2×35S启动子引物（2×35SF: TCCCCGCGGAGAGGCGGT TTGCGTATTGG，2×35SR:CTAGCTAGCAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT），用高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase（TaKaRa），以pCAMBIA 1301质粒DNA为模板，参照说明书进行PCR扩增反应，产物琼脂糖凝胶电泳检测后回收。载体pORE R1以Sac Ⅱ和Nhe I进行双酶切。将获得的PCR纯化产物与上述双酶切产物用TaKaRa的T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α），挑取阳性单克隆菌液双酶切验证、测序，获得重组载体pORE R12×35S:GUS。 P19由本实验室保存[14]。
1．2 试剂与仪器
1.2.1 试剂
总RNA分离试剂TaKaRa RNAiso Reagent、反转录酶Reverse Transcriptase MMLV、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18 Primer、dNTP mixture（10mM和2.5mM）、rTaq酶、Recombinant DNase Ⅰ（RNasefree）、SYBR? Premix Ex TaqTM购自TaKaRa（大连）公司；XGluc、DNA凝胶回收试剂盒Axygen Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 和AxyPrep质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司；cDNA合成试剂盒（SuperScript III Reverse Transcriptase）购于invitrogen公司；所用引物由捷瑞生物公司合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2载体与菌液2
1.2试剂与仪器 2
1.2.1试剂2
1.2.2仪器设备2
1.3试验方法3
1.3.1农杆菌介导法瞬时转化材料叶片3
1.3.2化学染色法检测筛选瞬时转化叶片中GUS表达4
1.3.3瞬时转化叶片的分子鉴定4
2结果与分析6
2.1瞬时转化材料选择6
2.2 pORE R12×35S:GUS瞬时转化植物叶片6
2.2.1瞬时转化后植物叶面表现6
2.2.2化学染色法检测转化叶片中GUS瞬时表达 7
2.2.3叶片中GUS瞬时表达RTPCR验证8
3讨论 9
（略）
致谢9
参考文献10
注：1. 目次中的内容一般列出“章”、“节”、“条”三级标题即可；
2．X、Y表示具体的阿拉伯数字；
增强型35S启动子在菊花转化中的应用
引言
菊花( Chrysanthemum morifolium Ramat.)，原产中国，是中国十大名花之一，同时也是世界四大切花之一，其观赏价值高，近年来在绿化美化中的应用越来越多，急需加大菊花品种选育及创新工 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
作的进度[1,2]。转基因技术的出现为菊花育种提供了全新的思路和途径。随着研究的进行，发现由于菊花遗传背景的复杂性，大量的外源基因在菊花中没有获得预期表达，传统的遗传转化方法在菊花中的应用受到较大的限制[3]。根癌农杆菌介导转基因技术在菊花中进行表达存在转化效率低、外源基因表达量低、嵌合体株率高及再生过程中基因沉默等问题；外植体的选择、抗生素的确定、易感菌株的选用、共培养条件等对转化效率起着决定性作用，且存在操作繁琐、周期长的问题，通常需要4～6个月，综合菊花转基因的成功案例中不同菌株的使用情况，遗传转化率低下，一般在5～40%[4,5]。CaMV 35S启动子在菊花中的转基因表达水平相对较低[6,7]。用无翻译增强子的CaMV 35S启动子驱动GUS基因瞬时表达，化学染色法检测GUS表达肉眼不可见蓝色[8]。为了进一步提高转入的外源目的基因在菊花中的表达水平，人们对35S启动子进行过多种改变，如将其343～90区域作顺向重复排列构成的35S双启动子2×35S便是成功的尝试[9,10]。农杆菌介导的瞬时表达方法是近年来发展形成的一种快速有效的分析蛋白质表达的方法，与传统的转基因过程相比较，具有周期短、安全高效、操作简易、费用相对较低、转化效率高、能同时感染多个品种的优点[11,12]。目前该方法已经在许多植物组织中取得了成功，但是在菊花中该方法还少见报道。
本试验提供一种将外源基因转入菊花中进行瞬时表达的方法，以农杆菌介导，2×35S为启动子，通过构建的植物表达载体pORE R12×35S:GUS，使外源基因GUS在菊花及菊花脑中进行瞬时表达，填补了目前农杆菌介导的瞬时表达在菊花中的空白，该体系的建立为在菊花叶片中基因功能的分析提供了有效手段，并以此为基础为进一步获得高效稳定的转基因菊花奠定了良好基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
供试材料为大学“中国菊花品种资源保存中心”保存的菊花脑(Chrysanthemum?nankingense)和2份切花菊品种‘神马’（Chrysanthemum morifolium Ramat. ‘Jinba’）、‘优香’（Chrysanthemum morifolium Ramat. ‘Youxiang’）。
1．1．2 载体和菌液
pORE R1（空载）[13]（购自TAIR）；载体pORE R12×35S:GUS由本实验室师兄宋爱萍构建，设计2×35S启动子引物（2×35SF: TCCCCGCGGAGAGGCGGT TTGCGTATTGG，2×35SR:CTAGCTAGCAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT），用高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase（TaKaRa），以pCAMBIA 1301质粒DNA为模板，参照说明书进行PCR扩增反应，产物琼脂糖凝胶电泳检测后回收。载体pORE R1以Sac Ⅱ和Nhe I进行双酶切。将获得的PCR纯化产物与上述双酶切产物用TaKaRa的T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α），挑取阳性单克隆菌液双酶切验证、测序，获得重组载体pORE R12×35S:GUS。 P19由本实验室保存[14]。
1．2 试剂与仪器
1.2.1 试剂
总RNA分离试剂TaKaRa RNAiso Reagent、反转录酶Reverse Transcriptase MMLV、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18 Primer、dNTP mixture（10mM和2.5mM）、rTaq酶、Recombinant DNase Ⅰ（RNasefree）、SYBR? Premix Ex TaqTM购自TaKaRa（大连）公司；XGluc、DNA凝胶回收试剂盒Axygen Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 和AxyPrep质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司；cDNA合成试剂盒（SuperScript III Reverse Transcriptase）购于invitrogen公司；所用引物由捷瑞生物公司合成。
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