燕麦秸秆青贮饲料中耐低温乳酸菌的理化特性及青贮效果研究
本试验对西藏日喀则地区燕麦秸秆青贮饲料中分离得到的两株乳酸菌菌株O1（戊糖片球菌）、O2（乳酸片球菌）进行生理生化特性研究。这两株乳酸菌菌株均能在5～30℃，pH3.5～7.0及3.0%和6.5% NaCl培养基中生长良好，其中O2在pH值为3的培养基中仍能生长，体现出这两株乳酸菌菌株具有耐低温，耐酸性和耐盐性强的特征。以这2株乳酸菌菌株做为青贮添加剂，进一步研究其在低温下对意大利黑麦草青贮饲料的添加效果。结果表明，在青贮温度为10℃时，添加这两株乳酸菌均显著降低了意大利黑麦草青贮饲料的pH值，乙酸和氨态氮含量，显著(P<0.05)提高乳酸、干物质、可溶性碳水化合物含量，乳酸菌的数量和乳酸与乙酸的比值，提高了青贮饲料的发酵品质。综合所有发酵品质指标，青贮温度为10℃时，添加乳酸菌O1组发酵品质最好，这表明戊糖片球菌O1最适合用做低温条件下的青贮添加剂。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 乳酸菌菌株2
1.2 乳酸菌菌株的生理生化特性2
1.3试验材料2
1.4菌种2
1.5 试验设计2
1.6试验方法2
1.7 数据处理3
2结果与分析3
2.1乳酸菌的分离与鉴定3
2.2分离乳酸菌菌株的表型和基因型特征3
2.3青贮原料意大利黑麦草化学与微生物成分分析6
2.4添加乳酸菌对低温条件下意大利黑麦草青贮饲料发酵品质的影响6
3讨论 7
4结论 8
致谢8
参考文献9
燕麦秸秆青贮饲料中耐低温乳酸菌的理化特性及青贮效果研究
引言
青贮是在厌氧条件下，乳酸菌将植物材料中的可溶性碳水化合物发酵为有机酸，主要为乳酸，快速降低青贮饲料pH值，从而达到长期保存的一种贮藏方式[1]。乳酸菌在青贮发酵过程中发挥着重要作用，青贮发酵品质受到植物附着的乳酸菌数量、活性和乳酸菌多样性影响[2]。乳酸菌能成功地发挥作用也取决于 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
环境温度[3]。青贮温度过低或过高，都不利于乳酸发酵。许多研究表明[46]对不同温度下柱花草（Stylosanthes guianensis）、玉米（Zea mays）和小麦（Triticum aestivum）的青贮品质进行分析，发现温度过低乳酸菌活性通常不强，而温度过高则会减少青贮饲料乳酸含量，提高pH值和干物质损失，降低有氧稳定性，使青贮饲料的饲用价值降低[7]。
青藏高原地势高亢，辐射强烈，且冷季漫长，暖季短暂，因其特殊的地理位置和生态环境，可能存在着特殊的耐低温乳酸菌种质资源[1]，发掘和利用青藏高原特有的乡土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对北方冬季低温条件下调制优质青贮饲料，促进畜牧业发展具有重要意义。意大利黑麦草（Lolium multiflorum）适应性强、分布广，生长速度快的优质牧草之一；其柔嫩多汁，可消化率高，因此被广泛种植使用。本试验旨在对西藏日喀则地区燕麦秸秆青贮饲料中分离获得的乳酸菌进行生物学特性研究，并将乳酸菌菌株做为青贮添加剂，研究其在低温下对意大利黑麦草青贮饲料的添加效果，为冬季低温条件下调制优质青贮饲料提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 乳酸菌菌株
从西藏燕麦秸秆青贮饲料中分离出的两种乳酸菌菌株，经鉴定O1为戊糖片球菌、O2为乳酸片球菌。
1．2 乳酸菌的生理生化特性检测
乳酸菌菌株的生理生化特性检测参考蔡义民[8]的方法，对两株乳酸菌菌株进行革兰氏染色试验；过氧化氢酶试验；葡萄糖产气试验。用待测菌株24h的培养液，以3%的接种量接入MRS液体培养基中，分别在5，10，15，30℃不同温度条件下培养，其中5℃下培养10d，10℃和15℃下培养5d，30℃下培养3d，观察乳酸菌菌株的生长情况。分别在pH3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0的MRS液体培养基中30℃培养3d，观察乳酸菌菌株的耐酸能力。分别在含有3.0％和6.5％NaCl的MRS液体培养基中30℃培养3d，观察乳酸菌的耐盐能力。利用API50CHL(bioMérieux, lEtoile, France)检测乳酸菌对49种不同碳源的同化能力。具体方法按照试剂盒的说明进行。
1．3 试验材料
试验将种植于大学牌楼试验地（东经118o51，北纬32o01，海拔25米）的意大利黑麦草刈割，刈割后在田间用铡刀切成2cm 左右，作为青贮材料。意大利黑麦草处于抽穗期。青贮材料化学成分和微生物组成见表3。
1．4 菌种
意大利黑麦草青贮试验选用分离于燕麦秸秆青贮饲料的2株乳酸菌作为添加剂。菌液用适量生理盐水调制为5 log cfu g1FW。
1．5 试验设计
试验采用随机区组设计，设对照组（C，无添加）和两个添加不同乳酸菌处理组（O1,O2），在温度10℃条件下青贮发酵，在青贮后第 30天打开青贮窖，取样分析发酵品质。处理3个重复。
1．6 试验方法
1．6．1 青贮饲料的调制
将意大利黑麦草刈割，用铡刀切成2cm 左右，处理组添加1ml菌液，对照组添加1ml无菌水，充分混匀后装填至1L 的实验室青贮窖中，压实盖上内外盖，并用胶带密封，置于温度为10℃的恒温培养箱中保存。
1．6．2 样品处理
在青贮第 30天打开实验室青贮窖取出全部青贮饲料，将其混合均匀称取35g 放入100ml的广口三角瓶，加入70g去离子水，4℃浸提24h，然后通过2 层纱布和定性滤纸过滤，所得液体为青贮饲料浸提液，置于20℃冷冻冰箱保存待测。滤液用来测定pH 值、氨态氮（ammonia nitrogen, AN）和有机酸（organic acids），将剩余部分青贮饲料收集烘干，测定干物质（dry matter，DM）、总氮（total nitrogen, TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates, WSC）。
1．6．3 测定项目及分析方法
原料草和青贮饲料在65℃烘箱中干燥60h 至恒定重量，测定干物质含量（dry matter，DM）；缓冲能（buffer capacity，BC）测定用盐酸氢氧化钠滴定法；pH 值用pH211 型精密pH 计（HANNA 公司）测定；水溶性碳水化合物用蒽酮硫酸比色法测定；氨态氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定；总氮用KjeltecTM2300 型全自动凯氏定氮仪测定；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸采用岛津LC20高效液相色谱仪测定：浸提液加入少量阳离子交换树脂，在12000rpm下离心3min后，0.45μm微孔滤膜过滤后测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。色谱条件：色谱柱（RSpak KC811,昭和电气），流动相为3mmol/L的高氯酸溶液，流速1mL/min，柱温60℃，检测器为SPD20A紫外检测器，检测波长210nm。乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌和霉菌数量采用平板计数法，分别选用MRS琼脂培养基（MRS agar medium，MRS）、营养琼脂培养基（nutrient agar）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar），35℃恒温培养3 天，对菌落数进行计数[9]。
1．7 数据处理
用Excel对数据进行整理，采用SPSS13.0软件对试验数据进行单因子方差分析（OneWay ANOVA），并用邓肯氏Duncan 方法对处理间及青贮温度间平均数进行多重比较（P<0.05）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 乳酸菌菌株2
1.2 乳酸菌菌株的生理生化特性2
1.3试验材料2
1.4菌种2
1.5 试验设计2
1.6试验方法2
1.7 数据处理3
2结果与分析3
2.1乳酸菌的分离与鉴定3
2.2分离乳酸菌菌株的表型和基因型特征3
2.3青贮原料意大利黑麦草化学与微生物成分分析6
2.4添加乳酸菌对低温条件下意大利黑麦草青贮饲料发酵品质的影响6
3讨论 7
4结论 8
致谢8
参考文献9
燕麦秸秆青贮饲料中耐低温乳酸菌的理化特性及青贮效果研究
引言
青贮是在厌氧条件下，乳酸菌将植物材料中的可溶性碳水化合物发酵为有机酸，主要为乳酸，快速降低青贮饲料pH值，从而达到长期保存的一种贮藏方式[1]。乳酸菌在青贮发酵过程中发挥着重要作用，青贮发酵品质受到植物附着的乳酸菌数量、活性和乳酸菌多样性影响[2]。乳酸菌能成功地发挥作用也取决于 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
环境温度[3]。青贮温度过低或过高，都不利于乳酸发酵。许多研究表明[46]对不同温度下柱花草（Stylosanthes guianensis）、玉米（Zea mays）和小麦（Triticum aestivum）的青贮品质进行分析，发现温度过低乳酸菌活性通常不强，而温度过高则会减少青贮饲料乳酸含量，提高pH值和干物质损失，降低有氧稳定性，使青贮饲料的饲用价值降低[7]。
青藏高原地势高亢，辐射强烈，且冷季漫长，暖季短暂，因其特殊的地理位置和生态环境，可能存在着特殊的耐低温乳酸菌种质资源[1]，发掘和利用青藏高原特有的乡土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对北方冬季低温条件下调制优质青贮饲料，促进畜牧业发展具有重要意义。意大利黑麦草（Lolium multiflorum）适应性强、分布广，生长速度快的优质牧草之一；其柔嫩多汁，可消化率高，因此被广泛种植使用。本试验旨在对西藏日喀则地区燕麦秸秆青贮饲料中分离获得的乳酸菌进行生物学特性研究，并将乳酸菌菌株做为青贮添加剂，研究其在低温下对意大利黑麦草青贮饲料的添加效果，为冬季低温条件下调制优质青贮饲料提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 乳酸菌菌株
从西藏燕麦秸秆青贮饲料中分离出的两种乳酸菌菌株，经鉴定O1为戊糖片球菌、O2为乳酸片球菌。
1．2 乳酸菌的生理生化特性检测
乳酸菌菌株的生理生化特性检测参考蔡义民[8]的方法，对两株乳酸菌菌株进行革兰氏染色试验；过氧化氢酶试验；葡萄糖产气试验。用待测菌株24h的培养液，以3%的接种量接入MRS液体培养基中，分别在5，10，15，30℃不同温度条件下培养，其中5℃下培养10d，10℃和15℃下培养5d，30℃下培养3d，观察乳酸菌菌株的生长情况。分别在pH3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0的MRS液体培养基中30℃培养3d，观察乳酸菌菌株的耐酸能力。分别在含有3.0％和6.5％NaCl的MRS液体培养基中30℃培养3d，观察乳酸菌的耐盐能力。利用API50CHL(bioMérieux, lEtoile, France)检测乳酸菌对49种不同碳源的同化能力。具体方法按照试剂盒的说明进行。
1．3 试验材料
试验将种植于大学牌楼试验地（东经118o51，北纬32o01，海拔25米）的意大利黑麦草刈割，刈割后在田间用铡刀切成2cm 左右，作为青贮材料。意大利黑麦草处于抽穗期。青贮材料化学成分和微生物组成见表3。
1．4 菌种
意大利黑麦草青贮试验选用分离于燕麦秸秆青贮饲料的2株乳酸菌作为添加剂。菌液用适量生理盐水调制为5 log cfu g1FW。
1．5 试验设计
试验采用随机区组设计，设对照组（C，无添加）和两个添加不同乳酸菌处理组（O1,O2），在温度10℃条件下青贮发酵，在青贮后第 30天打开青贮窖，取样分析发酵品质。处理3个重复。
1．6 试验方法
1．6．1 青贮饲料的调制
将意大利黑麦草刈割，用铡刀切成2cm 左右，处理组添加1ml菌液，对照组添加1ml无菌水，充分混匀后装填至1L 的实验室青贮窖中，压实盖上内外盖，并用胶带密封，置于温度为10℃的恒温培养箱中保存。
1．6．2 样品处理
在青贮第 30天打开实验室青贮窖取出全部青贮饲料，将其混合均匀称取35g 放入100ml的广口三角瓶，加入70g去离子水，4℃浸提24h，然后通过2 层纱布和定性滤纸过滤，所得液体为青贮饲料浸提液，置于20℃冷冻冰箱保存待测。滤液用来测定pH 值、氨态氮（ammonia nitrogen, AN）和有机酸（organic acids），将剩余部分青贮饲料收集烘干，测定干物质（dry matter，DM）、总氮（total nitrogen, TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates, WSC）。
1．6．3 测定项目及分析方法
原料草和青贮饲料在65℃烘箱中干燥60h 至恒定重量，测定干物质含量（dry matter，DM）；缓冲能（buffer capacity，BC）测定用盐酸氢氧化钠滴定法；pH 值用pH211 型精密pH 计（HANNA 公司）测定；水溶性碳水化合物用蒽酮硫酸比色法测定；氨态氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定；总氮用KjeltecTM2300 型全自动凯氏定氮仪测定；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸采用岛津LC20高效液相色谱仪测定：浸提液加入少量阳离子交换树脂，在12000rpm下离心3min后，0.45μm微孔滤膜过滤后测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。色谱条件：色谱柱（RSpak KC811,昭和电气），流动相为3mmol/L的高氯酸溶液，流速1mL/min，柱温60℃，检测器为SPD20A紫外检测器，检测波长210nm。乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌和霉菌数量采用平板计数法，分别选用MRS琼脂培养基（MRS agar medium，MRS）、营养琼脂培养基（nutrient agar）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar），35℃恒温培养3 天，对菌落数进行计数[9]。
1．7 数据处理
用Excel对数据进行整理，采用SPSS13.0软件对试验数据进行单因子方差分析（OneWay ANOVA），并用邓肯氏Duncan 方法对处理间及青贮温度间平均数进行多重比较（P<0.05）。
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