一株砷氧化自养细菌的分离及特性研究
当今社会环境污染问题日益加剧，重金属污染更是不容忽视。作为重金属污染的代表污染物之一，砷广泛存在于自然界中，对人体和其他生物造成各类危害。探究其原理会发现，As(III)的毒性要远高于As(V)。本课题采用分离、富集的方法，从砷污染场地的土壤中分离筛选出具备As(III)氧化能力的功能细菌，进行形态观察、生理生化特性研究和16S rDNA基因鉴定并研究其自养功能和最佳培养条件。结果表明，筛选出的菌株Shinella sp. C1为化能自养细菌，氧化As(III)的最适温度为37℃。通过模拟土培实验法，研究了As(III)氧化功能菌株Shinella sp. C1对水稻吸收砷的影响。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1□材料与方法 2
1.1□样品来源 2
1.2□砷氧化菌株的富集与分离 2
1.3□砷氧化菌株的鉴定 2
1.3.1□形态结构观察及生理生化实验 2
1.3.2□16S rDNA基因扩增和测序 3
1.4□砷氧化菌C1生长特性研究 3
1.4.1□电子受体实验 3
1.4.2□电子供体实验 3
1.5□砷氧化菌C1对As(III)氧化特性的研究 4
1.5.1□砷浓度对As(III)氧化的影响 4
1.5.2□菌株氧化As(III)最适温度的测定 4
1.6□土壤泥浆实验 4
2□结果与分析 5
2.1□砷氧化菌株的富集与分离 5
2.2□砷氧化菌株的鉴定 5
2.3□砷氧化菌C1生长特性 7
2.4□砷氧化菌C1对As(III)的氧化特性 8
2.5□土壤泥浆实验 9
3□讨论 10
致谢 10
参考文献 11
一株砷氧化自养细菌的分离及特性研究
引言
砷（As）是自然界中普遍存在的一种毒性强、具有致癌性且具累积作用的类金属元素[1]。环境砷污染主要来自于以砷化物为主要成分的农 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
药以及含砷工业废物的排放、富砷煤的燃烧等[2, 3]。土壤中砷积累到一定程度，可导致土壤退化、农作物产量及品质下降,甚至通过食物链途径危害人体健康[4, 5]。长期以来，土壤中砷污染问题普遍存在，砷污染土壤的治理刻不容缓。在土壤中砷主要以离子形式存在，有As(III)与As(V)两种价态，而三价砷As(III)比五价砷As(V)毒性高约100倍[6]，As(III)的氧化被视为是一种解毒机制[7]。自然界中As(III)的氧化主要由As(III)氧化细菌参与和驱动，而砷的非生物(化学)氧化过程非常缓慢，目前有报道指出能氧化As(III)的异养型细菌主要有粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) [8]，土壤杆菌(Agrobacterium albertimagni) [9]和嗜热栖热菌( Thermus thermoph ilus HB8) [10]等， 自养型砷氧化微生物通常具有多种代谢方式，它们也可以在好氧或厌氧的条件下附通过氧化As (III)获得能量代谢有机物进行生长[11, 12]，对淹水条件下土壤砷污染修复具有重要意义。这些菌之所以能氧化As(III), 是因为它们含有的As(III)氧化酶能催化氧化As(III)，砷氧化菌将毒性强的三价砷氧化为毒性弱且易被吸的五价砷，对砷污染修复具有重要应用意义。为寻求环保、高效、无二次污染治理砷污染土壤的生物修复方法，本课题拟从砷污染水稻土壤中筛选出砷氧化自养细菌，为微生物法治理砷污染土壤提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 样品来源
本实验所用土壤样品采自湖南郴州砷污染区，采集回来后4℃保存。
1．2 砷氧化菌株的富集与分离
称取1 g土样，加入到装有100 mL CDM液体培养基的三角瓶中，加入NaAsO2，使其浓度为100 mg?L1，放于37℃、 150 r?min1摇床培养5 d。以1%的接种量转接到上述培养基中，相同条件下再培养5 d。将富集液稀释涂布于含有100 mg?l1 As（III）的CDM培养基平板上，37℃培养箱培养5 d。挑取平板上生长出的As(III)抗性细菌，进行分离纯化，直至得到单菌落。
使用KMnO4定性检测方法[13]将上述得到的As(III)抗性菌转接到加入NaAsO2后终浓度为100 mg?l1的CDM液体培养基中，放于37℃、150 r?min1摇床培养3 d，取1 mL菌液，加入20 μl浓度为0.01 M KMnO4溶液检测。
1．3 砷氧化菌株的鉴定
1．3．1 形态结构观察及生理生化实验 对分离得到的菌株进行革兰氏染色、并进行电镜拍照。降解菌株的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》进行[14, 15]。
1．3．2 16S rDNA基因扩增和测序 菌株16S rDNA 的克隆及序列测定和比较参照文献（奥斯伯F，1999）[16]。提取C1的基因组DNA作为模板，进行16S rDNA基因的扩增。1对引物分别为：5’端引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，3’端引物 5’TACCTTGTTACGACTT3’。25μL 体系为：模板1μL，dNTP(25 mmol?L1) 2μL，引物(1 mmol?L1 ) 各1μL ，10 ×Taq 缓冲液2.5μl ，Mg2+ (25 mmol?L1) 1.5μL，Taq 酶(5 U?μL1) 0.3μL ，超纯水15.7μL 。聚合酶链式反应条件：95℃，3 min；94℃，1 min；55℃, 1 min；72℃，3 min； 循环30 次，72℃延伸10 min。测序由金斯瑞公司完成。测序结果通过在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与GenBank 中的16S rDNA 基因序列进行相似性比较。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1□材料与方法 2
1.1□样品来源 2
1.2□砷氧化菌株的富集与分离 2
1.3□砷氧化菌株的鉴定 2
1.3.1□形态结构观察及生理生化实验 2
1.3.2□16S rDNA基因扩增和测序 3
1.4□砷氧化菌C1生长特性研究 3
1.4.1□电子受体实验 3
1.4.2□电子供体实验 3
1.5□砷氧化菌C1对As(III)氧化特性的研究 4
1.5.1□砷浓度对As(III)氧化的影响 4
1.5.2□菌株氧化As(III)最适温度的测定 4
1.6□土壤泥浆实验 4
2□结果与分析 5
2.1□砷氧化菌株的富集与分离 5
2.2□砷氧化菌株的鉴定 5
2.3□砷氧化菌C1生长特性 7
2.4□砷氧化菌C1对As(III)的氧化特性 8
2.5□土壤泥浆实验 9
3□讨论 10
致谢 10
参考文献 11
一株砷氧化自养细菌的分离及特性研究
引言
砷（As）是自然界中普遍存在的一种毒性强、具有致癌性且具累积作用的类金属元素[1]。环境砷污染主要来自于以砷化物为主要成分的农 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
药以及含砷工业废物的排放、富砷煤的燃烧等[2, 3]。土壤中砷积累到一定程度，可导致土壤退化、农作物产量及品质下降,甚至通过食物链途径危害人体健康[4, 5]。长期以来，土壤中砷污染问题普遍存在，砷污染土壤的治理刻不容缓。在土壤中砷主要以离子形式存在，有As(III)与As(V)两种价态，而三价砷As(III)比五价砷As(V)毒性高约100倍[6]，As(III)的氧化被视为是一种解毒机制[7]。自然界中As(III)的氧化主要由As(III)氧化细菌参与和驱动，而砷的非生物(化学)氧化过程非常缓慢，目前有报道指出能氧化As(III)的异养型细菌主要有粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) [8]，土壤杆菌(Agrobacterium albertimagni) [9]和嗜热栖热菌( Thermus thermoph ilus HB8) [10]等， 自养型砷氧化微生物通常具有多种代谢方式，它们也可以在好氧或厌氧的条件下附通过氧化As (III)获得能量代谢有机物进行生长[11, 12]，对淹水条件下土壤砷污染修复具有重要意义。这些菌之所以能氧化As(III), 是因为它们含有的As(III)氧化酶能催化氧化As(III)，砷氧化菌将毒性强的三价砷氧化为毒性弱且易被吸的五价砷，对砷污染修复具有重要应用意义。为寻求环保、高效、无二次污染治理砷污染土壤的生物修复方法，本课题拟从砷污染水稻土壤中筛选出砷氧化自养细菌，为微生物法治理砷污染土壤提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 样品来源
本实验所用土壤样品采自湖南郴州砷污染区，采集回来后4℃保存。
1．2 砷氧化菌株的富集与分离
称取1 g土样，加入到装有100 mL CDM液体培养基的三角瓶中，加入NaAsO2，使其浓度为100 mg?L1，放于37℃、 150 r?min1摇床培养5 d。以1%的接种量转接到上述培养基中，相同条件下再培养5 d。将富集液稀释涂布于含有100 mg?l1 As（III）的CDM培养基平板上，37℃培养箱培养5 d。挑取平板上生长出的As(III)抗性细菌，进行分离纯化，直至得到单菌落。
使用KMnO4定性检测方法[13]将上述得到的As(III)抗性菌转接到加入NaAsO2后终浓度为100 mg?l1的CDM液体培养基中，放于37℃、150 r?min1摇床培养3 d，取1 mL菌液，加入20 μl浓度为0.01 M KMnO4溶液检测。
1．3 砷氧化菌株的鉴定
1．3．1 形态结构观察及生理生化实验 对分离得到的菌株进行革兰氏染色、并进行电镜拍照。降解菌株的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》进行[14, 15]。
1．3．2 16S rDNA基因扩增和测序 菌株16S rDNA 的克隆及序列测定和比较参照文献（奥斯伯F，1999）[16]。提取C1的基因组DNA作为模板，进行16S rDNA基因的扩增。1对引物分别为：5’端引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，3’端引物 5’TACCTTGTTACGACTT3’。25μL 体系为：模板1μL，dNTP(25 mmol?L1) 2μL，引物(1 mmol?L1 ) 各1μL ，10 ×Taq 缓冲液2.5μl ，Mg2+ (25 mmol?L1) 1.5μL，Taq 酶(5 U?μL1) 0.3μL ，超纯水15.7μL 。聚合酶链式反应条件：95℃，3 min；94℃，1 min；55℃, 1 min；72℃，3 min； 循环30 次，72℃延伸10 min。测序由金斯瑞公司完成。测序结果通过在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与GenBank 中的16S rDNA 基因序列进行相似性比较。
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